/178503.djvu

			POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE
WIKTOR RZECZYCKI
BIA??KA
ZASADOWE MITOCHONDRI??W
NERKI WIEPRZA
WARSZAWA 1964
POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE
WIKTOR RZECZYCKI
BIA??KA
ZASADOWE MITOCHONDRI??W
NERKI WIEPRZA
WARSZAWA 1964
BIA??KA ZASADOWE
MITOCHONDRIOW NERKI WIEPRZA
POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE
MONOGRAFIE
BIOCHEMICZNE
5
WARSZAWA
WIKTOR RZECZYCKI
BIA??KA
ZASADOWE MITOCHONDRI??W
NERKI WIEPRZA
PA??STWOWE WYDAWNICTWO NAUKOWE
HONOROWY KOMITET REDAKCYJNY
WANDA MAJBAUM KATZENELLENBOGEN, W??ODZIMIERZ MOZO??OWSKI,
ZDZIS??AW STOLZMAN
REDAKTOR: HALINA CETNAROWICZ
Praca habilitacyjna
wykonana w Zak??adzie Chemii Fizjologicznej Akademii Medycznej w Gda??sku
Kierownik Zak??adu prof. dr W??odzimierz Mozo??owski
PA??STWOWE WYDAWNICTWO NAUKOWE ??? WARSZAWA 1964
Nak??ad 500+100 egz. Ark. wyd. 2,5. Ark. druk. 2,5. Papier druk. sat. III kl. 80 g,
70/100. Oddano do sk??adu 15.VIII.64 r. Druk uko??czono w grudniu 1964 r.
Zam. nr 2754 L-l	Cena z?? 12.???
BIA??OSTOCKIE ZAK??ADY GRAFICZNE
SPIS TRE??CI
1.	Wst??p	 7
2.	Materia??y i metody	 8
3.	Charakterystyka bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? 0,2 M kwasem sulfosalicy-
lowym z frakcji podkom??rkowych nerki wieprza	15
4.	Izolacja oraz charakterystyka aminokw'asowa bia??ka katodowego z mito-
chondri??w nerki	wieprza	21
5.	Bia??ko zasadowe mitochondri??w nerki wieprza jako inhibitor aktywno??ci
enzym??w	  26
6.	Wnioski	8??
Pi??miennictwo	88
.
1. WST??P
Ostatnio coraz cz????ciej pojawiaj?? si?? prace, kt??re s?? po??wi??cone funkcji
bia??ek zasadowych; na og???? dotycz?? one bia??ek j??der kom??rkowych. Prace
te obejmuj?? szeroki zakres zagadnie??. W przegl??dzie og??oszonym przeze
mnie w Post??pach Biochemii [1] uj????em je w dwie grupy. W grupie pier??
wszej om??wiono wp??yw bia??ek zasadowych na reakcje enzymatyczne,
takie jak aktywno???? enzym??w szeregu Warburga-Keilina, rozkojarzenie
fosforylacji oksydacyjnych, aktywno???? fosforylaz, krzepni??cie krwi, czyn??
no??ci metaboliczne j??dra kom??rkowego.W grupie drugiej przedstawiono
ich wp??yw na zjawiska bezpo??rednio nie zwi??zane z reakcjami enzymatycz??
nymi, takie jak pobudliwo???? tkanki nerwowej na bod??ce elektryczne, li-
pemia pokarmowa, wp??yw na bakterie, bakteriofagi i wirusy oraz na
nowotwory. W znanym mi pi??miennictwie nie znalaz??em ??adnych danych
o bia??kach zasadowych mitoehondri??w, je??eli pominiemy rol?? ??ytochro-
mu c, kt??ry jest bia??kiem zasadowym, a wyst??puje w mitochondriach
w du??ych ilo??ciach.
R????ne sposoby ekstrakcji bia??ek z kom??rki daj?? wyci??gi o rozmaitym
sk??adzie bia??kowym. Zastosowanie ekstrakcji kwasem sulfosalicylowym,
a nast??pnie zag??szczania ekstrahowanych bia??ek metod?? taninowo-kofei-
now?? [2,5] pozwoli??o mi stwierdzi??, ??e z nerki wieprza ekstrahuj?? si?? bia????
ka zasadowe pochodz??ce w przewa??aj??cej cz????ci z mitoehondri??w. Wyst????
powanie bia??ek zasadowych w elementach kom??rkowych o tak wielkim
znaczeniu w przemianie materii nakazywa??o bli??sze ich zbadanie.
Obecna praca mia??a za zadanie wydzielenie mo??liwie jednolitych frakcji
bia??ek zasadowych, zbadanie ich sk??adu aminokwasowego oraz ich wp??ywu
na najistotniejsze przemiany enzymatyczne mitoehondri??w. Uzyskane
przeze mnie wyniki dotycz?? zatem trzech ??ci??le ????cz??cych si?? ze sob?? te??
mat??w, a mianowicie: a) charakterystyki bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa??
kwasem sulfosalicylowym z frakcji podkorm??rkowych nerki wieprza,
b) izolacji bia??ka katodowego z mitoehondri??w ????cznie z jego charakte??
rystyk?? aminokwasow?? oraz c) inhibicji aktywno??ci enzym??w szeregu
Warburga-Keilina przez zasadowe bia??ko mitoehondri??w nerki wieprza.
Dlatego, po rozdziale opisuj??cym stosowane metody, podano wyniki kolej??
no wed??ug wy??ej wymienionych zagadnie??.
2.	MATERIA??Y I METODY
Frakcje podkom??rkowe nerki wieprza. Nerki pobierano od zwierz??cia
w oko??o 10 minut po zabiciu i przenoszono je w lodzie do pracowni. Dalsze
operacje przeprowadzano w temperaturze 1???2??. Z nerek usuwano mied-
niczk?? ??? torebk?? oraz t??uszcz, a nast??pnie mielono je przez maszynk?? do
mi??sa. Po zmieleniu homogenizowano w 10 obj??to??ciach 0,25 M sacharozy
w homogenizatorze (Waring blendor) przez 2 minuty. Homogenat s??czono
przez dwie warstwy gazy, aby oddzieli?? wi??ksze niezhomogenizowane
cz????ci. J??dra odwirowywano przy 800Xg przez 10 minut. P??yn znad osadu
wirowano nast??pnie przy 10 000Xg ??? otrzymuj??c osad ci????kich mito-
ehondri??w, a nast??pnie przy 25 000 Xg ??? przez 10 minut, otrzymuj??c osad
lekkich mitochondri??w. Zbierano poszczeg??lne frakcje, tj. j??dra, lekkie
i ci????kie mitochondria oraz p??yn znad osadu mitochondri??w, zawieraj????
cy cytoplazm?? i mikrosomy. Osady frakcji podkom??rkowych przemy??
wano dwukrotnie (osad j??der czasami pi??ciokrotnie) 0,25 M sacharoz??.
Pop??uczyny by??y zwykle odrzucane, z wyj??tkiem pop??uczyn j??der kom??r??
kowych, w kt??rych badano bia??ka. W tych do??wiadczeniach j??dra otrzy??
mane z dw??ch nerek przemywano oko??o 300 ml roztworu sacharozy. Po
przemyciu odwirowywano osad przy 25 000Xg, a p??yn znad osadu u??ywa??
no do nast??pnego p??ukania tych samych j??der. T?? procedur?? powtarzano
dwukrotnie.
Ekstrakcja bia??ek kwasem sulfosalicylowym z element??w podkom??rko??
wych, z pe??nego homogenatu oraz z pop??uczyn j??der kom??rkowych.
Wszystkie badania prowadzono w temperaturze 0???10??. Ekstrahowano
bia??ka 0,2 M kwasem sulfosalicylowym w nast??puj??cy spos??b: do pe??nego
homogenatu, p??ynu znad osadu mitochondri??w oraz do pop??uczyn j??der
kom??rkowych dodawano w odpowiedniej ilo??ci 4 M kwasu sulfosalicylo-
wego, tak aby ko??cowe st????enie tego kwasu wynosi??o 0,2 M; j??dra i mito??
chondria zawieszano najpierw w czterech obj??to??ciach wody i nast??pnie
dodawano pi???? obj??to??ci 0,4 M kwasu sulfosalicylowego. Nast??pnie po??
szczeg??lne frakcje homogenizowano przez 3 minuty i po 30-minutowym
odstaniu si?? wirowano przy 1500Xg. P??yn znad osadu s??czono przez
bibu???? Whatman nr 3, a bia??ka znajduj??ce si?? w roztworze zag??szczano,
Ekstrakcja bia??ek z j??der kom??rkowych kwasem siarkowym. Przepro??
wadzono j?? 0,2 N H2S04 [6], rozcieraj??c j??dra z kwasem, w ch??odzonym lo??
dem homogenizatorze Pottera przez 10 minut. Roztw??r pozostawiano przez
1 godzin?? w lod??wce, homogenizowano ponownie i wirowano przy 8000Xg.
P??yn znad osadu s??czono i doprowadzano do pH 6,5 wodorotlenkiem sodu.
Powsta??y osad bia??ek oboj??tnych [7] ods??czano, otrzymuj??c klarowny p??yn
zawieraj??cy bia??ka (przede wszystkim histony), kt??re nast??pnie zag??szcza??
no metod?? taninowo-kofeinow??.
Zag??szczanie ekstrakt??w bia??kowych metod?? taninowo-kofeinow?? [2,3].
Aby przekona?? si??, w jakim zakresie pH nast??puje ca??kowite wytr??cenie
bia??ka tanin?? z ekstrakt??w kwasu sulfosalicylowego, zbadano zale??no????
pomi??dzy ilo??ci?? wytr??conego bia??ka a pH tego ekstraktu. Wyniki przed??
stawia rysunek 1. Przy stosunku bia??ka do taniny wynosz??cym 1:0,5 ca????
kowite wytr??cenie zachodzi w pH 3???7. Przy stosunku bia??ka do taniny
Rys. 1. Wp??yw pH na wytr??canie tanin?? bia??ek
rozpuszczalnych w kwasie sulfosalicylowym.
Do 1,8 ml buforu o r????nym pH [2] dodawano 0,1 ml
bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicylo??
wym (150 i*-g) i 0,1 ml 0,075#/o roztworu taniny. Po p????
godzinie str??t taninowo-bia??kowy odwirowywano i w
p??ynie nad osadem oznaczano bia??ko turbidimetrycz-
n?? metod?? taninow??. Stosunek bia??ka do taniny wy??
nosi?? 1:0,5.
wynosz??cym 1:1 lub 1:2 precypitacja zachodzi w szerszych granicach pH.
Na podstawie tego do??wiadczenia ekstrakt kwasu sulfosalicylowego dopro??
wadzano zawsze do pH 4???6 i bia??ka wytr??cano dwukrotn?? ilo??ci?? taniny.
Regeneracj?? tych bia??ek kofein?? przeprowadzano tak, jak podaje Mej-
baum-Katzenellenbogen, zachowuj??c stosunek bia??ka do kofeiny jak 1:2
[3]. Otrzymane zag??szczone roztwory zawiera??y 2???4% bia??ka. Bia??ka da??
j??ce si?? ekstrahowa?? z j??der kom??rkowych kwasem siarkowym zag????
szczono powy??sz?? metod??, dodaj??c do wyci??gu taniny, tak ??e na 1 g bia??ka
przypada??o 5 g taniny; regeneracj?? kofein?? przeprowadzano przy stosun??
ku bia??ka do kofeiny 1:2. Otrzymywano roztwory bia??ek 2???4%.
Elektroforeza bibu??owa bia??ek. Roztwory zawieraj??ce 2???4% bia??ka
poddawano elektroforezie bibu??owej na bibule Whatman nr 1 przy
pH 8,6. U??ywano pask??w o wymiarach 3X28 cm oraz buforu weronalo-
wego o pH 8,6 i mocy jonowej 0,05 [8], Nanoszono oko??o 10???15 ul bada??
nego roztworu zawieraj??cego od 0,5???1 mg bia??ka w odleg??o??ci 2 cm od
??rodka w kierunku katody na pasek bibu??y zwil??ony uprzednio buforem.
10
Przyk??adano napi??cie 200 V, a rozdzia?? trwa?? fi???7 godzin. Nast??pnie paski
suszono w 105?? przez 15 minut i wybarwiano bia??ka roztworem b????kitu
bromofenolowego. Poszczeg??lne wybarwione frakcje wycinano, eluowano
barwnik 0,1 N NaOH i oznaczano ekstynkcj?? przy 590 mu [8] zak??adaj??c,
??e st????enie bia??ka jest wprost proporcjonalne do ilo??ci barwnika po????czo??
nego z bia??kiem.
Oznaczanie ilo??ciowe bia??ek. U??ywano zawsze metody turbidimetrycz-
nej Mejbaum-Katzenellenbogen [9], z wyj??tkiem oznacze?? bia??ek we
frakcjach elektroforetycznych. Niekiedy pos??ugiwano si?? tak??e oznacze??
niami ekstynkcji roztwor??w bia??ek przy 280 mu [10].
Frakcjonowanie bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicyle??
wym na kolumnie z karboksymetyloceluloz??.
Zag??szczone roztwory bia??ek, daj??ce si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosali-
cylowym z homogenat??w nerki wieprza, dializowano przez 24 godziny
w wodzie destylowanej. Powsta??y po dializie osad odwirowywano, nast??-
w
Rys. 2. Zestaw do chromatografii kolum??
nowej na karboksymetylocelulozie, pozwa??
laj??cy uzyska?? gradient st????e?? chlorku po??
tasu.
A ??? naczynie, w kt??rym nast??puje mieszanie
si?? p??ynu dop??ywaj??cego z naczynia B z p??ynem
znajduj??cym si?? w naczyniu A; B ??? naczynie
zawieraj??ce p??yn o sta??ym st????eniu KC1 (0,6 M);
C ??? naczynie pozwalaj??ce utrzyma?? sta??y po??
ziom p??ynu w naczyniu B; D ??? kolumna z kar-
boksymetyloceluloz??; E ??? kolektor frakcji
z prob??wkami; M ??? mieszad??o elektromagne??
tyczne.
pnie liofilizowano i przechowywano do czasu wykonania frakcjonowania
w ???10??. Frakcjonowanie przeprowadzano na kolumnie z karboksymety??
loceluloz?? o wymiarach 1X15 cm. Karboksymctyloceluloz?? zawieszano
w 0,05 M buforze octanowym o pH 4,2 (10 g celulozy w 500 ml buforu).
Po kilku minutach celuloza osiada, a p??yn dekantowano; tak przemyt??
celuloz?? zawieszano ponownie w 100 ml buforu i wprowadzano do kolum??
ny. Nast??pnie uk??adano j?? pod ci??nieniem 120 cm s??upa wody. Bia??ko
(50 mg) rozpuszczono w 5 ml buforu octanowego i nanoszono na szczyt
kolumny. Po wessaniu ca??ego roztworu do wn??trza ??ywicy ??cianki ko??
lumny p??ukano 1???2 ml buforu i eluowano bia??ko gradientem st????e?? chlor??
ku potasu. Gradient taki mo??na uzyska?? w specjalnej aparaturze (rys. 2).
W kolbie A, w kt??rej nast??puje mieszanie p??ynu za pomoc?? mieszade??ka
elektromagnetycznego, umieszczano 150 ml buforu octanowego, natomiast
11
naczynie B i C po????czone z naczyniem A jest nape??niane 0,6 M KC1 w bu??
forze octanowym. Naczynie A jest po????czone z kolumn?? D. Podczas elucji
bia??ka z kolumny ilo???? p??ynu w naczyniu A jest wielko??ci?? sta????, po??
niewa?? jest uzupe??niana z naczynia B 0,6 M KC1. Oczywi??cie st????enie
KC1 w naczyniu A b??dzie wzrasta??o, a r??wnocze??nie b??dzie wzrasta??o
st????enie KC1 w eluacie. Zbierano 3 ml frakcje co 10 minut, pos??uguj??c si??
kolektorem frakcji (E). St????enie chlorku potasu w ka??dej frakcji mo??na
wyliczy?? z r??wnania podanego przez Cherkina i wsp. [11J:
C | Co = (ek ??? l)ek,
gdzie C ??? st????enie p??ynu opuszczaj??cego naczynie A, C0 ??? st????enie p??ynu
w naczyniu B, k ??? stosunek obj??to??ci zebranego eluatu do ob??
j??to??ci p??ynu w naczyniu A, e ??? podstawa logarytmu naturalnego.
W ka??dej frakcji oznaczano bia??ko metod?? taninow?? i ekstynkcj?? przy
280 m??, w kuwetach 1 cm. Frakcje odpowiadaj??ce ka??demu ze szczyt??w
bia??kowych zbierano, dializowano w wodzie destylowanej przez 24 godzi??
ny, zmieniaj??c 2???3 razy wod??, liofilizowano i do dalszych do??wiadcze??
przechowywano w ???10??.
Oznaczanie sk??adu aminokwasowego bia??ka zasadowego mitochondri??w
nerki wieprza.
Hydrolizowano bia??ko 6 N kwasem solnym lub 14% Ba(OH)2 przez
30 godzin (B??ock i wsp. s. 80 i 83 [12]). Po hydrolizie aminokwasy identy??
fikowano oraz oznaczano ilo??ciowo przy pomocy chromatografii bibu??owej.
Do hydrolizy kwa??nej u??yto 6 mg badanego bia??ka, a do zasadowej 3 mg.
Hydrolizaty rozpuszczano odpowiednio w 1 i 0,5 ml wody, a nast??pnie
nanoszono je w ilo??ci 20 ??l na paski bibu??y Whatman nr 1 o wymiarach
3X30 cm, kt??re u??ywano do chromatografii wyst??puj??cej jednowymiaro??
wej, lub w ilo??ci 50 ??l na arkuszu bibu??y o wymiarach 20X30 cm, u??y??
waj??c ich do chromatografii dwuwymiarowej, technik?? wst??puj??c??.
U??ywano nast??puj??ce uk??ady rozpuszczalnik??w [12]:
1.	n-butanol: kwas octowy: H20 = 4:l:l (obj.).
2.	2,6 ??? lutydyna: kolidyna: H20=1:1:1 (obj.)+2% dwuetyloaminy.
3.	aceton: mocznik: H20= 60:0,5:40 (obj. wag. obj.).
4.	pirydyna: H20=65:25 (obj.).
5.	r-pikolina: H20=60:40 (obj.).
6.	pirydyna: alkohol izoamylowy: H20: dwuetyloamina ??? 10:10:7:0,3
(obj.).
7.	n-butanol: kw. mr??wkowy: H2O=60:5:5 (obj.).
8.	III rz-butanol: metyoetyloketon: H20:dwuetyloamina: ??? 40:40:20:4
(obj.).
9.	fenol: H20 ??? 100:20 + 0,3% NH3 (obj.).
10.	pirydyna: kw. octowy: H20 ??? 50:35:15 (obj.).
Wszystkie paski w chromatografii jednowymiarowej rozwijano
w uk??adzie nr 1 trzykrotnie. Ten sam uk??ad rozpuszczalnik??w by?? u??yty
12
do rozwini??cia chromatogramu dwuwymiarowego w jednym kierunku;
w drugim u??yto uk??adu nr 2, rozwijaj??c chromatogramy w tym uk??adzie
dwukrotnie. Po rozwini??ciu chromatogramy suszono, spryskiwano 0,5%
roztworem ninhydryny w acetonie i zabarwienie wywo??ywano w tempe??
raturze oko??o 60??. Aminokwasy identyfikowano przez por??warnie war??
to??ci Rf plam nieznanych aminokwas??w z warto??ciami Rf ich standart??w.
W przypadkach w??tpliwych wycinano miejsca na bibule odpowiadaj??ce
tym niezidentyfikowanym aminokwasom, eluowano je wod?? i rechromato-
grafowano w kilku z podanych powy??ej uk??ad??w rozpuszczalnik??w. Do??
datkowo obecno???? metioniny mo??na by??o wykry?? lub wy????czy?? przez
utlenienie wod?? utlenion?? nakropionego na bibu???? hydrolizatu. Metionina
ulega utlenieniu na S02 ??? metionin??. Powsta??a S02 ??? metionina w??druje
wolniej ni?? nieutleniona metionina w uk??adzie n-butanol: kw. octowy:
H20 = 4:1:1 (obj.). Cystein?? identyfikowano wykonuj??c na bibule swoisty
test z nitroprusydkiem sodu [12],
Ilo??ciowe oznaczanie aminokwas??w.
Po trzykrotnym rozwini??ciu chromatogramu z nakropionym kwa??nym
hydrolizatem bia??ka, w uk??adzie nr 1, tj. n-butanol: kw. octowy: H20 ???
??? 4:1:1 (obj.), aminokwasy z wyj??tkiem proliny oznaczane metod??
Meyera [13] w modyfikacji Krebsa i wsp. [14], Prolin?? oznaczono metod??
Messera [15], kt??r?? dostosowano do oznacze?? tego aminokwasu na bibule
w nast??puj??cy spos??b: Z tego samego chromatogramu spryskanego odczyn??
nikiem ninhydrynowym, w kt??rym oznaczono inne aminokwasy, wycina??
no bibu???? z ??????t?? plam?? proliny, ci??to j?? na kawa??ki i umieszczano w pro??
b??wce, dodawano 1 ml wody, a nast??pnie oznaczano dalej wed??ug Messera
[15], Aminokwasy, kt??re w tym uk??adzie w??drowa??y razem, oznaczono
jako sum??. W ten spos??b na jednym chromatogramie oznaczono wszystkie
aminokwasy: leucyn?? i (lub) izoleucyn??, walin??, prolin??, alanin??, treonin??
????cznie z kwasem glutaminowym, glicyn?? z seryn?? i kwasem asparagino??
wym, arginin?? oraz lizyn?? z histydyn??. Aby oznaczy?? stosunek ilo??ciowy
aminokwas??w w??druj??cych razem, wycinano z chromatogram??w nie-
wywo??anych odpowiadaj??ce im pola (cz????ciowo z s??siaduj??cymi amino??
kwasami) i rozwijano w uk??adach, w kt??rych otrzymywano ich dobry roz??
dzia??. Po rozdziale oznaczano je ilo??ciowo i obliczano ilo??ciowy wzajemny
stosunek tych aminokwas??w. Znaj??c ten stosunek oraz znaj??c warto????
sumy aminokwas??w w??druj??cych razem, wyliczano bezwzgl??dne ilo??ci po??
szczeg??lnych aminokwas??w, kt??re w uk??adzie nr 1, tj. n-butanol: kw.
octowy: H20 ??? 4:1:1 (obj.), nie oddzielaj?? si?? od siebie.
Stosunek ilo??ciowy treoniny do kwasu glutaminowego oznaczano po
rechromatografii eluatu wodnego odpowiedniego pola chromatogramu
rozwijanego w uk??adzie nr 1, w uk??adzie nr 2, tj. 2,6-lutydyna: kolidyna:
H20 ??? 1:1:1 (obj.) z dodatkiem 2% dwuetyloaminy, rozwijaj??c dwu??
krotnie chromatogram. Otrzymywano dobry rozdzia?? treoniny od kwasu
13
glutaminowego i ewentualnie od innych bezpo??rednio z nimi s??siaduj????
cych aminokwas??w, tj. alaniny, seryny i glicyny. Treonin?? i kwas gluta??
minowy oznaczono ilo??ciowo nast??puj??co: chromatogram spryskiwano od??
czynnikiem ninhydrynowym z dodatkiem 4% (obj.) kwasu octowego.
Zabarwienie wywo??ywano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej,
a dalej post??powano ??ci??le tak, jak ???to opisa?? Krebs i wsp. [14].
Ilo??ciowy stosunek seryny, glicyny i kwasu asparaginowego oznacza??
no po rechromatografii odpowiednich eluat??w wodnych, w uk??adzi?? nr 9,
tj. fenol: II20 ??? 100:20 4-0,3% NH3 (rozwijano dwa razy). Nast??pnie chro-
matogramy spryskiwano odczynnikiem ninhydrynowym, ale bez kwasu
octowego, a zabarwienie wywo??ywano w temperaturze pokojowej przez
dwie godziny. Dalszy ci??g oznaczania przeprowadzano wed??ug Krebsa
i wsp. [14].
Mo??na tak??e w podobny spos??b oznaczy?? stosunek lizyny do histydyny
po rechromatografii w uk??adzie nr 8, tj. III rz.-butanol: metyloetyloketon:
H20: dwuetyloamina ??? 40:40:20:4 (obj.). W badanym przypadku by??o
jednak bardzo ma??o histydyny, a bai???dzo du??y nadmiar lizyny, dlatego te??
tego Stosunku nie oznaczono, poniewa?? by??by obarczony du??ym b????dem.
Oznaczenie zwi??zanych z bia??kiem heksoz i kwasu sjalowego. Kwas
sjalowy oznaczano metod?? rezorcynow?? [16], a heksozy metod?? orcy-
now?? [17],
Preparatyka mitochondri??w z nerki i w??troby wieprza oraz szczura,
w kt??rych nast??pnie oznaczano aktywno???? enzym??w szeregu Warburga-
-Keilina. Tkank?? homogenizowano w 9 obj??to??ciach 0,25 M sacharozy
w homogeni satorze Pottera, och??odzonego wod?? z lodem. Odwirowywano
j??dra przy 600Xg, a p??yn znad osadu wirowano przy 20 OOOX'g przez
10 minut. Odwirowane mitochondria przemywano dwukrotnie 0,25 M
sacharoz??, tak aby mitochondria 1 g tkanki znajdowa??y si?? w 1 ml p??ynu.
Podczas preparatyki mitochondri??w oraz podczas ich przechowywania
temperatura wynosi??a 0??.
Oznaczenie aktywno??ci oksydazy cytochromowej w preparatach mi-
tochondrialnych [18].
Aktywno???? tego enzymu oznaczano manometrycznie w aparacie
Warburga w temperaturze 37??. W 3 ml p??ynu inkubacyjnego znajdo??
wa??y si?? mitochondria (0,1???0,2 mg N), cytochrom c ??? 2,5X10-7 mola,
bufor fosforanowy (Na) o pH 7,4 ??? 10"4 mola, askorbinian sodu o pH
7,0 ??? 3X10-5 mola oraz A1CI3 ??? 10???6 mola. Powstaj??cy podczas inkubacji
dwutlenek w??gla poch??aniano 0,2 ml 10% KOH i mierzono zu??ycie tlenu
po 10, 20 i 30 minutach inkubacji.
Oznaczanie aktywno??ci oksydazy bursztynowej w preparatach mito-
chondrialnych [18],
Oznaczenie przeprowadzono w aparacie Warburga w temperaturze 37??.
W ka??dym naczy??ku znajdowa??o si?? 3 ml p??ynu inkubacyjnego zawieraj??-
14
cego mitochondria (0,2???0,4 mg N), cytochrom c ??? 5X10"8 mola, bufor
fosforanowy (Na) o pH 7,4 ??? 10~4 mola, bursztynian sodu o pH 7,4 ???
3X10-4 mola, CaCl2 ??? 10-6 mola oraz A1C13 ??? 10-6 mola. Dwutlenek w??gla
poch??aniano wodorotlenkiem potasu. Mierzono zu??ycie tlenu po 10, 20 i 30
minutach inkubacji.
Oznaczanie aktywno??ci reduktazy eytochromu c zale??nej od kwasu
bursztynowego w preparatach mitochondrialnych [19].
Pomiar przeprowadzano spektrofotometrycznie, mierz??c przyrost eks??
tynkcji przy 550 mu- (przyrost zredukowanego eytochromu c) w mieszani??
nie inkubacyjnej, kt??ra w obj??to??ci 3 ml zawiera??a mitochondria (0,015 ???
0,030 mg N), bufor fosforanowy (Na) o pH 7,4 ??? 10-4 mola, cytochrom
c ??? 10~7 mola, KCN ??? 3X10-6 mola oraz bursztynian sodu o pH 7,4 ???
3X10'5 mola. Oznaczanie ekstynkcji wykonywano w spektrofotometrze
Unicam, przy grubo??ci warstwy 1 cm, mierz??c j?? co 20 sekund przez
3 minuty, przy temperaturze pokojowej wahaj??cej si?? w! r????nych seriach
oznacze?? od 21???25??. Z warto??ci ekstynkcji wyliczono st????enie powsta??e??
go, zredukowanego eytochromu c w molach, przez pomno??enie przez
wsp????czynnik r??wny 5,35X10~5 wyliczony przez Slattera [19] z molowego
wsp????czynnika ekstynkcji podanego przez Theorella i wsp. [20].
Oznaczenie aktywno??ci reduktazy eytochromu c zale??nej od NADH2
w preparatach mitochondrialnych [19].
Aktywno???? tego uk??adu enzymatycznego oznaczono spektrofotometrycz??
nie w identyczny spos??b jak aktywno???? reduktazy eytochromu c zale??nej
od kwasu bursztynowego, z tym, ??e zamiast bursztynianu sodu dodawano
3X10-7 mola NADH2.
W do??wiadczeniach, w kt??rych badano wp??yw zasadowych bia??ek mi??
tochondrialnych nerki wieprza oraz wp??yw protaminy na wy??ej wymie??
nione reakcje enzymatycz??e, przed rozpocz??ciem oznaczenia, dodawano
odpowiednie ilo??ci tych substancji do p??yn??w inkubacyjnych.
Oznaczanie azotu ca??kowitego w preparatach mitochondrialnych. Azot
ca??kowity w poszczeg??lnych preparatach mitochondrialnych oznaczano
metod?? Kjeldahla.
Odczynniki: tanina, kofeina, weronal sodu ??? Cefarm Warszawa. Kwas sulfosali-
cylowy ??? Unia Warszawa. Sacharoza do preparatyki mitochondri??w, u??ywanych na??
st??pnie do bada?? proces??w oksydoredukcyjnych by??a cz.d.a., do innych cel??w u??y??
wano zwyczajn?? kupn?? sacharoz??. Karboksymetyloceluloza ??? Serva. Ninhydryna
cz. ??? BDH. Cytochrom c ??? Biosedra Francja, w roztworze; w 1 ml znajdowa??o si??
3 mg eytochromu c. Siarczan protaminy cz. ??? ???przepakowano Gliwice???. NADH2 ???
Sigma. EDTA ??? s??l dwusodowa cz.d.a. rekrystalizowana z wody. Fenol cz., metyloe-
tyloketon cz., 2,6 ??? lutydyna cz., kolidyna cz.; oraz dwuetyloamina cz. u??ywano po
uprzedniej redestylacji. Inne u??ywane odczynniki by??y cz.d.a.
3.	CHARAKTERYSTYKA BIA??EK DAJ??CYCH SI?? EKSTRAHOWA??
0,2 M KWASEM SULFOSALICYLOWYM Z FRAKCJI
PODKOM??R KO W YCII NERKI WIEPRZA
W j??drach kom??rkowych wyst??puj?? dobrze znane bia??ka zasadowe,
protaminy i histony [21, 22]. Bardzo ma??o wiadomo o innych bia??kach
zasadowych wyst??puj??cych w kom??rce. Burgston i wsp. [23] w kr??tkim
doniesieniu podaj??, ??e w przypadkach guz??w w??troby daje si?? wyek??
strahowa?? bia??ka, kt??re na kolumnie z dwuetyloaminoceluloz?? dziel?? si??
na szczyty bia??kowe A do F. Szczyt A bia??ek, kt??ry wzrasta w guzach
w??troby, elektroforetycznie daje si?? podzieli?? na 4 komponenty w??dru??
j??ce do katody. W nast??pnym doniesieniu [24] wy??ej wymienieni autorzy
podaj??, ??e z tkanek mo??na wyekstrahowa?? 0,3 N kwasem nadchlorowym
glikoproteid z domieszk?? kilku zasadowych bia??ek tkankowych, nie
opisanych poprzednio. Rzeczycki i Hillar ekstrahuj?? kwasem sulfosali-
cylowym mieszanin?? bia??ek z r????nych tkanek zwierz??cych oraz kom??rek
nowotworowych guza Erlicha u myszy; bia??ka te dziel?? si?? elektrofore??
tycznie na szereg frakcji, z kt??rych kilka w??druje do katody [25], Z sar-
kop??azmy mi????nia kr??lika Hartshorne i Perry po rozdziale na DEAE
celulozie otrzymuj?? kilka frakcji bia??kowych; niekt??re z tych bia??ek
w??druj?? podczas elektroforezy do katody przy pH 9,1 [26], Z r????nych
narz??d??w tkanek zwierz??cych mo??na kwasem siarkowym wyekstrahowa??
kilka r????nych zasadowych polipeptyd??w, maj??cych dzia??anie antybakte-
ryjne [27, 28], Wolfe i Mcllwain podaj??, ??e w mikrosomach kary m??zgo??
wej znajduje si?? bli??ej nie sprecyzowane bia??ko zasadowe, r????ni??ce si??
od histon??w mniejsz?? zawarto??ci?? argininy [6]. W mitochondriach znaj??
duje si?? bia??ko zasadowe ??? cytochrom c. W dost??pnej mi literaturze nie
znalaz??em natomiast doniesie?? m??wi??cych o innych bia??kach zasadowych
wyst??puj??cych w mitochondriach.
Stwierdzenie bia??ek zasadowych mitochondri??w nerki wieprza opie??
ram na nast??puj??cych do??wiadczeniach. Z homogenat??w nerki wieprza
0,2 M kwasem sulfosalicylowym ekstrahuj?? si?? bia??ka, kt??re po zag??szcze??
niu daj?? si?? rozdzieli?? elektroforetycznie przy pH 8,6 na kilka frakcji;
niekt??re z nich (oko??o 30% ca??o??ci bia??ek) w??druj?? do katody. Rysunek 3
przedstawia elektroforogram bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem
16
sulfosalicylowym z ca??kowitego homogenatu nerki wieprza oraz elektro-
forogram bia??ek surowicy wieprza.
Z por??wnania wynika, ??e z homogenatu nerki ekstrahuj?? si?? bia??ka
w??druj??ce przy pH 8,6 do katody. Brak jest natomiast tego rodzaju bia??ek
w surowicy. W ekstraktach kwasu sulfosalicylowcgo nie ma frakcji bia????
kowej odpowiadaj??cej albuminom surowicy. To do??wiadczenie nasun????o
Rys. 3. Elektroforogramy bibu??owe (1)
bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwa??
sem sulfosalicylowym z homogenatu
nerki wieprza i (2) bia??ek ca??kowitych
surowicy wieprza. A i B ??? frakcje
bia??ek katodowych.
przypuszczenie, ??e bia??ka katodowe daj??ce si?? ekstrahowa?? kwasem sul??
fosalicylowym z ca??ego homogenatu nerki mog?? pochodzi?? z j??der kom??r??
kowych i s?? histonami. Aby o tym si?? przekona??, por??wnano elektroforo??
gramy bia??ek wyekstrahowanych z j??der kom??rkowych 0,2 M kwasem
sulfosalicylowym i 0,2 N kwasem siarkowym (rys. 4), wiadomo bowiem,
??e kwasem siarkowym ekstrahuj?? si?? przede wszystkim histony [7].
Rys. 4. Elektroforogramy bibu??owe bia??
??ek j??der kom??rkowych nerki wieprza
(1) daj??cych si?? ekstrahowa?? 0,2 M
kwasem sulfosalicylowym (300 bia????
ka) i (2) daj??cych si?? ekstrahowa?? 0,2 N
H2S04 (150 |xg bia??ka).
Z por??wnania wynika, ??e bia??ka tych dw??ch ekstrakt??w r????ni?? si??
mi??dzy sob?? i wobec tego bia??ka ekstrahuj??ce si?? kwasem sulfosalicylo??
wym nie mog?? by?? identyczne z histonami, daj??cymi si?? ekstrahowa??
kwasem siarkowym. Ruchliwo???? elektroforetyczna frakcji najszybciej
w??druj??cej do katody w ekstraktach kwasem sulfosalicylowym z j??der
kom??rkowych jest podobna do ruchliwo??ci elektroforetycznej frakcji A
w ca??ym homogenacie.
Ilo??ci bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicylowym
z j??der kom??rkowych s?? bardzo ma??e, mog?? one zatem pochodzi?? od do??
mieszek innych frakcji podkom??rkowych. Je??eli przemywa si?? j??dra
szereg razy 0,25 M sacharoz??, to w miar?? przemywania jest coraz mniej
bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicylowym. (Ilustruje to
tabela 1).
17
Z tabeli tej wynika, ??e z nieprzemytych j??der ekstrahuje si??
100???150 mg bia??ka na 100 g j??der kom??rkowych, a z przemytych oko??o
10 razy mniej. Ilo???? bia??ek daj??ca si?? ekstrahowa?? z przemytych j??der
kom??rkowych jest bardzo ma??a, dlatego te?? ich st????enie w ekstraktach
kwasu sulfosalicylowego jest bardzo niskie (1???10 mg%) i uchwytne tylko
dzi??ki zastosowaniu mikrometody taninowej oznaczenia bia??ek [9]. Dane
tabeli 1 mo??na t??umaczy?? w dwojaki spos??b; kilkakrotne p??ukanie w zna??
cznej mierze usuwa zanieczyszczenia innymi frakcjami podkom??rkowymi
oraz ca??ymi kom??rkami, st??d coraz mniejsze ilo??ci bia??ek daj?? si?? ekstra??
howa?? kwasem sulfosalicylowym z j??der w miar?? ich coraz dok??adniej??
szego przemywania; mo??na te?? przypu??ci??, ??e p??ukanie j??der du??ymi
ilo??ciami sacharozy wyp??ukuje z nich bia??ka i dlatego potem ekstrahu??
je si?? ich coraz mniej kwasem sulfosalicylowym. To drugie przypuszcze??
nie wydaje si?? nie s??uszne, poniewa?? w pop??uczynach j??der, przygoto??
wanych tak jak to podano w metodach, nie mo??na by??o stwierdzi?? ??ladu
bia??ek katodowych, podczas gdy w ekstraktach kwasu sulfosalicylowego
60% ca??o??ci bia??ek stanowi frakcja katodowa A. Do??wiadczenie to na??
sun????o przypuszczenie, ??e bia??ka katodowe daj??ce si?? ekstrahowa?? kwasem
sulfosalicylowym z ca??ego homogenatu nerki wieprza pochodz?? z innych
element??w podkom??rkowych ni?? j??dra kom??rkowe. Aby si?? o tym prze??
kona??, por??wnano ze sob?? elektroforogramy bia??ek ekstrahuj??cych si??
kwasem sulfosalicylowym z homogenatu pozbawionego j??der, z mito-
chondri??w oraz z p??ynu po odwirowaniu mitochondri??w (rys. 5).
Tabela 1
Wp??yw przemywania na ilo???? bia??ek daj??cych
si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicylowym z j????
der kom??rkowych nerki wieprza
J??dra kom??rkowe wyizolowane z dw??ch nerek prze??
mywano 500 ml porcjami 0,25 roztworu sacharozy
J??dra kom??rkowe
Wyekstrahowane bia??ka
(mg/100 g j??der)
Nie myte
100???150
Myte dwa razy
30???50
Myte pi???? razy
6???13
Z por??wnania wynika, ??e frakcja A bia??ek w??druj??cych do katody
(g????wna frakcja bia??ek katodowych) jest bia??kiem specyficznym dla mito??
chondri??w, nie ma jej natomiast w p??ynie po odwirowaniu mitochondri??w
zawieraj??cych mikrosomy i cytoplazm??. Obraz elektroforetyczny bia??ek
mitochondrialnych rozpuszczalnych w kwasie sulfosalicylowym jest
bardzo podobny do obrazu elektroforetycznego bia??ek daj??cych si?? ekstra??
howa?? tym kwasem z j??der kom??rkowych (rys. 4), a ich ilo???? stale ma??
leje w miar?? przemywania frakcji j??drowej (tab. 1). Obrazy elektro-
18
Rys. 5. Rozdzia?? elektroforetyczny bia??
??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem
sulfosalicylowym z (1) homogenatu po??
zbawionego j??der, (2) z mitochondri??w
(frakcji odwirowanej pomi??dzy 800???
25 000Xg), (3) z p??ynu znad osadu po
odwirowaniu mitochondri??w przy
25 000 Xg.
foretyczne bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicylowym
z ci????kich mitochondri??w (odwirowanych pomi??dzy 600???10 000Xg) oraz
lekkich (10 000???25 000Xg) nie r????ni?? si?? mi??dzy sob??. Tabela 2 charak??
teryzuje ilo??ciowo bia??ka rozpuszczalne w kwasie sulfasalicylowym
z poszczeg??lnych frakcji kom??rkowych oraz podaje procentow?? zawarto????
frakcji A w tych bia??kach.
Tabela 2
Ilo???? bia??ek ca??kowitych oraz 'procentowa zawarto???? bia??ek
frakcji A, tj. najszybciej w??druj??cej do katody w wyci????
gach kwasu sulfosalicylowego z r????nych element??w kom??r??
kowych nerki wieprza. Poszczeg??lne liczby przedstawiaj??
warto??ci ??rednie z dw??ch do??wiadcze??
Frakcja pod kom??rkowa
Bia??ko
(mg 1 g
suchej wagi)
Frakcja A
Co)
J??dra przemyte dwa razy
0,25 M sacharoz??
0,12
60
Homogenat pozbawiony
j??der
3,8
35
Mitochondria odwirowane
przy 800???25 000 Xg
3,2
68
P??yn znad osadu po od??
wirowaniu mitochondri??w
przy 25 000 X g
1,1
0,03
Bia??ka frakcji A mitochondri??w stanowi?? zatem 70% wszystkich bia??
??ek ekstrahuj??cych si?? z tych element??w kom??rkowych. Z j??der prze??
mywanych dwa razy 0,25 M sacharoz??, ilo???? bia??ka daj??ca si?? ekstraho??
wa?? kwasem sulfosalicylowym stanowi tylko kilka procent bia??ek
ekstrahuj??cych si?? z homogenatu po odwirowaniu j??der. Bia??ka z j??der
kom??rkowych zawieraj?? te?? w przybli??eniu ten sam procent frakcji A
co bia??ka wyekstrahowane z mitochondri??w.
19
Wy??ej wymienione dane do??wiadczalne stwierdzaj?? obecno???? bia??ek
katodowych w mitochondriach nerki wieprza. W zwi??zku z tym nale??y
przedyskutowa?? nast??puj??ce sprawy. Uzyskane wyniki wskazuj??, ??e naj??
szybciej w??druj??ca frakcja A bia??ek katodowych nerki wieprza rozpu??
szczalna w kwasie sulfosalicylowym pochodzi z frakcji mitochondrialnej,
zar??wno z ci????kiej (800???10 000Xg), jak lekkiej (10 000???25 000Xg). Frak??
cja lekkich mitochondri??w mo??e by?? jednak zanieczyszczona mikrosoma-
mi, kt??re te?? mog?? zawiera?? podobne bia??ka katodowe. Jednak g????wna
ilo???? mikrosom??w w tych warunkach nie daje si?? odwirowa?? (25 000 Xg
przez 10 minut) i pozostaje w p??ynie nad osadem. Dlatego te?? stwierdzenie,
??e z tego p??ynu nie mo??na otrzyma?? tego rodzaju bia??ka, wyklucza mo??
??liwo???? ekstrakcji frakcji A bia??ek katodowych z mikrosom??w. Dane tabe??
li 2 podaj?? ilo???? bia??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? z poszczeg??lnych frakcji
podkom??rkowych oraz procentow?? zawarto???? frakcji A, s?? to warto??ci
przybli??one. Sk??adaj?? si?? na to nast??puj??ce przyczyny: po pierwsze, roz??
dzia?? elektroforetyczny na bibule poszczeg??lnych frakcji bia??kowych
z natury rzeczy nie jest doskona??y, po drugie, oznacze?? ilo??ciowych do??
konano zak??adaj??c, ??e ka??da z frakcji bia??kowych wi????e b????kit bromofeno-
lowy proporcjonalnie do ilo??ci bia??ka, co, jak wiadomo, nie zawsze jest
s??uszne. Po trzecie, oznaczanie suchej wagi poszczeg??lnych frakcji ko??
m??rkowych jest obarczone du??ym b????dem ze wzgl??du na obecno???? sacha??
rozy, chocia?? odpowiedni?? poprawk?? wprowadzono, ale nie mo??na jej zbyt
??ci??le obliczy??. Obecno???? frakcji katodowej A w ekstraktach kwasem sul??
fosalicylowym j??der kom??rkowych nale??y chyba przypisa?? niewielkiej
domieszce mitochondri??w lub nie uszkodzonych kom??rek. Za tym przy??
puszczeniem przemawiaj?? do??wiadczenia przedstawione na tabeli 1. Nato??
miast ma??o prawdopodobna jest mo??liwo????, ??e frakcja bia??ek katodo??
wych A pochodzi z j??der kom??rkowych i mo??e by?? identyczna ze znany??
mi bia??kami zasadowymi j??der, tj. histonami. Przeciwko temu ostatniemu
przypuszczeniu przemawiaj?? wyniki do??wiadcze?? przedstawione na rys. 4;
obraz elektroforetyczny bia??ek ekstrahuj??cych si?? kwasem siarkowym,
a wi??c histon??w, jest r????ny od obrazu bia??ek rozpuszczalnych w kwasie
sulfosalicylowym. Mo??na by zarzuci?? temu do??wiadczeniu, ??e przy za??
g??szczaniu ekstrakt??w kwasu siarkowego metod?? taninowo-kofeinow?? nie
wszystkie bia??ka jednakowo regeneruj?? si?? kofein?? po uprzednim ich wy??
tr??ceniu tanin??; mog??oby si?? zatem zdarzy??, ??e histony nie przechodz??
do roztworu. Je??eli zatem przyjmiemy to ostatnie przypuszczenie za s??usz??
ne, to jednak frakcja A bia??ek katodowych nie mo??e by?? identyczna
z histonami nieregeneruj??cymi si?? kofein??, poniewa?? daje si?? ona dobrze
regenerowa?? tym odczynnikiem. Mo??e si?? zdarzy?? tak??e, ??e cz?????? histon??w
wytr??ci??a si?? w osadzie bia??ek oboj??tnych przy doprowadzeniu ekstraktu
kwasu siarkowego do pH 6,5 [7], Tego rodzaju frakcja bia??ek oboj??tnych
nie daje si?? jednak wytr??ci?? z ekstrakt??w kwasu sulfosalicylowego. Po??
zostaje zatem przyj????, ??e histony nie ekstrahuj?? si?? 0,2 M kwasem sulfo-
20
salicylowym z j??der kom??rkowych nerki wieprza. I??umaczy?? to mo??na
albo tym, ??e kwas ten nie odszczepia histonu od kwasu nukleinowego
i dlatego nie przechodzi, to bia??ko do roztworu, albo ??e histony s??
bia??kami nierozpuszczalnymi w roztworach kwasu sulfosali??ylowego.
Wy??ej podane rozwa??ania nie os??abiaj?? zatem wniosku, ??e w mitochon-
driach nerki wieprza obecne jest bia??ko w??druj??ce podczas elektroforezy
przy pH 8,6 do katody.
4. IZOLACJA ORAZ CHARAKTERYSTYKA AMINOKWASOWA
BIA??KA KATODOWEGO Z MITOCHONDRI??W NERKI WIEPRZA
Metody wydzielania poszczeg??lnych bia??ek zasadowych z mieszanin
bia??kowych mo??na podzieli?? na dwie grupy. Pierwsza to r????nego rodzaju
wytr??canie bia??ka, np. przy pomocy etanolu [29], druga to chromatografia
na ??ywicach jonowymiennych. Najcz????ciej u??ywane ??ywice to Amberlit
IRC ??? 50 [30] oraz karboksymetyloceluloza [31]. W tej pracy pos??u??o??
no si?? chromatografi?? na karboksymetylocelulozie.
Poniewa?? frakcja A bia??ek katodowych pochodzi z mitochondri??w
(co wykazano w poprzednim rozdziale), u??yto do izolacji tej frakcji bia??
??ek daj??cych si?? ekstrahowa?? kwasem sulfosalicylowym z ca??ej nerki,
bez uprzedniego dzielenia jej na poszczeg??lne elementy podkom??rkowe.
Na kolumnie z karboksymetyloceluloz?? bia??ka te dziel?? si?? na trzy szczy??
ty (rys. 6).
Rys. 6. Rozdzia?? chromatograficzny bia??ek rozpuszczalnych
w kwasie sulfosalicylowym z homogenat??w nerki wieprza,
na kolumnie z karboksymetyloceluloz??.
Na kolumn?? o wymiarze 1X15 cm, nape??nion?? karboksymetylocelu??
loz?? zawieszon?? w 0,#5 M buforze octanowym o pil 4,2 nanoszono
50 mg bia??ka rozpuszczonego w 5 ml tego buforu. Bia??ko eluowano
gradientem st????e?? chlorku potasu. Naczynie, w kt??rym nast??powa??o
mieszanie p??yn??w, zawiera??o sta???? ilo???? 150 ml buforu octanowego,
w naczyniu uzupe??niaj??cym znajdowa??o si?? 0,6 M KC1 w buforze
octanowym. Zbierano frakcje trzymilimetrowe co 10 min.
22
Bia??ka szczytu I charakteryzuj?? si?? znaczn?? absorpcj?? przy 280 mu; bia????
ka szczytu II mniej absorbuj?? ??wiat??o przy tej samej d??ugo??ci fali, nato??
miast bia??ka szczytu III praktycznie wcale nie poch??aniaj?? tej d??ugo??ci
fali ??wiat??a nadfioletowego. Wynika st??d, ??e bia??ka szczytu I powinny
zawiera?? bardzo du??o aminokwas??w aromatycznych. O wiele mniej tych
aminokwas??w jest w bia??kach szczytu II, a szczyt III nie zawiera ich
wcale lub bardzo ma??o. Rysunek 7 przedstawia obraz elektroforetyczny
bia??ek tych trzech szczyt??w oraz obraz elektroforetyczny bia??ek przed
rozdzia??em.
Szczyt I charakteryzuje si?? jedn?? frakcj?? przesuni??t?? w kierunku anody,
szczyt II posiada kilka frakcji, a w tym jedn?? w??druj??c?? do katody (frak??
cja B), natomiast bia??ka szczytu III w??druj?? tak jak bia??ka frakcji kato??
dowej A z mitochondri??w. W bia??kach tych po zliofilizowaniu oznaczano
ilo??ciowy i jako??ciowy sk??ad aminokwasowy.
Rys. 7. Elektroforeza bibu??owa bia??ek rozpuszczalnych
w kwasie sulfosalicylowym z homogenat??w nerki wieprza,
przed i po chromatografii na karboksymetylocelulozie.
Bufor weronalowy pH 8,6. 1 ??? bia??ka rozpuszczalne w kwasie sul??
fosalicylowym homogenatu nerki wieprza; 2(1) ??? bia??ka szczytu I
otrzymane z chromatografii na karboksymetylocelulozie; 3 (II) ???
bia??ka szczytu II; 4 (III) ??? bia??ka szczytu III; A ??? szybciej w??dru??
j??ca i B ??? wolniej w??druj??ca katodowa frakcja bia??ek.
Rysunek 8 przedstawia dwuwymiarowy chromatogram kwa??nego
hydrolizatu bia??ek szczytu III. Sk??ad aminokwasowy jest nast??puj??cy:
leucyna i (lub) izoleucyna, walina, prolina, alanina, treonina, kwas gluta??
minowy, glicyna, seryna, kwas asparaginowy, lizyna razem z arginin??
i histydyna. Nieobecno???? tryptofanu potwierdzono chromatografuj??c
hydrolizaty zasadowe. Brak cystyny i cysteiny stwierdzono dodatkowo na
podstawie ujemnej pr??by z nitroprusydkiem. Metionin?? wy????czono chro??
matografi?? hydrolizat??w bia??kowych utlenianych za pomoc?? wody utle??
nionej.
W uk??adzie n-butanol: kw. octowy: H20 ??? 4:1:1 (obj.) metionina
w??druje przed utlenieniem razem z walin??, natomiast po utlenieniu znaj??
duje si?? w innym miejscu. W badanych hydrolizatach bia??kowych nie
stwierdzono zmiany po??o??enia plamy odpowiadaj??cej walinie po utlenie??
niu jej wod?? utlenion??.
n
i
2
5
9
e# -
Rys. 8. Dwuwymiarowy chromatogram bibu??owy kwa??nego hydrolizatu bia??ek
frakcji A.
r ??? kierunek, n-butanol: kw. octowy: H20 = 4:1:1 (obj.), trzy razy rozwijany; II ??? kierunek,
2,fi ??? lutydyna : kolidyna : H20 = 1:1:1 (obj.) z dodatkiem 2% dwuetyloaminy, dwa razy roz??
wijany; 1 ??? leucyna i (lub) izoleucyna; 2 ??? walina; 3 ??? prolina; 4 -- alanina; 5 ??? treonina;
6 ??? kwas glutaminou'y; 7 ??? glicyna; 8 ??? seryna; 9 ??? kwas asparaginowy; 10 ??? lizyna z argi-
nin??; 11 ??? histydyna.
Dla sk??adu aminokwasowego badanego bia??ka bardzo charakterys??
tyczny jest brak aminokwas??w aromatycznych i siarkowych. Brak ami??
nokwas??w aromatycznych w bia??kach szczytu III jest zgodny z brakiem
absorpcji przy 280 mu. Tabela 3 przedstawia ilo??ciowy sk??ad aminokwa-
sowy bia??ek szczytu III dla trzech preparat??w.
Tabela 3
Sk??ad aminokwasowy frakcji katodowej A bia??ek mitochondri??w nerki wieprza
Bia??ka izolowano za pomoc?? chromatografii na karboksymetylocelulozie, nast??pnie po hydroli??
zie 6N kwasem solnym aminokwasy rodzielono pos??uguj??c si?? chromatografi?? bibu??ow??
i opr??cz histydyny oznaczono kolorymetrycznie. (Szczeg????y podano w metodach).Podano war??
to??ci ??rednie+??rednie odchylenie. Dla preparatu I i II zrobiono po 6 oznacze??, dla preparatu
II ??? 7 oznacze??
Ilo???? moli poszczeg??lnych aminokwas??w przypadaj??-
Aminokwas
cych na 100 moli
aminokwas??w obecnych w hydroli??
zacie bia??kowym
I
II
III
Histydyna
< 1
< 1
< 1
Kw. asparaginowy
0,7??0,1
0,8+0,1
0,7+0,1
Leucyna
2,0??0,5
5,2+0,5
4,1??0,6
Walina
2,6+0,5
4,1 + 1,0
3,3??0,9
Arginina
3,6 ??0,3
2,7 ??0,1
3,1??0,5
Seryna
4,7??0,7
6,9??0,9
6,1??0,6
Kw. glutaminowy
6,1+0,5
6,2??0,7
6,9??0,6
Treonina
6,1 + 0,5
6,2??0,6
6,9??0,6
Glicyna
8,1+0,6
11,4??0,8
10,1 ??0,9
Prolina
16,0??2,8
15,4??1,4
14,2+1,5
Alanina
17,2??1,0
17,8+0,7
16,7 ??1,3
Lizyna
32,3??2,1
23,1+2,5
27,5??3,4
24
Z przedstawionych liczb wynika, ??e oko??o 30% wszystkich aminokwa??
s??w stanowi?? aminokwasy zasadowe, w tym lizyna stanowi oko??o 25%,
arginina tylko kilka procent, a histydyny jest mniej ni?? 1%. Z amino??
kwas??w niezasadowych proliny i alaniny jest oko??o 15%, glicyny oko??o
10??/o, innych aminokwas??w: ??eucyny, waliny, kwasu glutaminowego
i treoniny kilka procent, a kwasu asparaginowego mniej ni?? 1 %. Cztery
aminokwasy: lizyna, prolina, alanina i glicyna, stanowi?? oko??o 70% ca??o??
??ci aminokwas??w, podczas gdy 8 pozosta??ych stanowi reszt??, tj. oko??o 30??/o
ca??o??ci. Pr??by n?? heksoz?? i kwas sjalowy w bia??kach szczytu III s?? ujem??
ne. ??wiadczy to o braku komponenty w??glowodanowej w tych bia??kach.
Tabela 4
Sk??ad aminokwasowy niekt??rych bia??ek zasadowych
Druga kolumna podaje sk??ad preparatu III zasadowego bia??ka mitochondrialnego wyizolowa??
nego z nerki wieprza. Nast??pne kolumny podaj?? sk??ad innych bia??ek zasadowych wzi??tych
z pi??miennictwa [30, 32, 33, 34],
Ilo???? moli poszczeg??lnych aminokwas??w przypadaj??cych na 100
moli aminokwas??w obecnych w hydrolizacie bia??kowym
Aminokwas
bia??ko za??
sadowe mi-
tochondri??w
salmi-
na ??o??
sosia
[32]
histony grasicy
[30]
rybonukle-
aza trzust??
kowa [33]
lizozym
bia??ka jaja
kurzego [34]
Frak.
A
Frak.
B
Frak.
C
Alanina
16,7
0,45
17,66
7,67
12,55
9,7
8,0
Arginina
3,1
89,80
6,74
19,76
12,68
3,2
9,7
Cysteina
0,06
0,06
0,06
6,5
6,4
Feniloalanina
0,45
0,91
0,77
2,5
2,4
Glicyna
10,1
1,80
5,19
5,49
4,71
2,5
8,8
Histydyna
1
0,15
4,90
2,07
3,2
0,8
Izoleucyna
0,44
0,77
2,95
1,52
2,5
4,8
Leucyna
4,1
3,31
5,42
4,06
1,6
6,4
Kw. asparagin.
0,7
1,52
3,53
2,15
12,0
16,0
Kw. glutamin.
6,9
2,62
5,62
3,86
9,7
3,2
Lizyna
27,5
36,09
16,97
24,68
8,1
4,8
Metionina
0,06
0,62
0,29
3,2
1,6
Prolina
14,2
2,70
6,67
2,64
4,20
3,2 '
1,6
Seryna
6,6
2,94
2,49
2,34
12,1
7,2
Treonina
6,9
3,12
3,33
2,44
2,84
8,1
5,6
Tryptofan
4,8
Tyrozyna
0,38
1,69
0,73
4.6
3,2
Walina
3,3
1,40
3,81
4,33
2,97
7,3
4,8
Azot amidowy
nie ozn.
4,51
8,39
5,82
14,5
Chromatografuj??c na karboksymetylocelulozie bia??ka nerki wieprza
rozpuszczalne w kwasie sulfosalicylowym mo??na wyizolowa?? bia??ko, kt??re
jest elektroforetycznie homogenne i odpowiada frakcji katodowej A. Pow??
tarzalno???? wynik??w oznaczenia poszczeg??lnych aminokwas??w w trzech
r????nych preparatach tego bia??ka jest r????na dla r????nych aminokwas??w.
25
Dla niekt??rych z nich, np. alaniny czy proliny, r????nice w oznaczaniu s??
niewielkie, dla innych, takich jak leucyna czy walina, s?? do???? znaczne.
Te r????nice pomi??dzy zawarto??ci?? aminokwas??w w poszczeg??lnych pre??
paratach bia??ka frakcji A mo??na by t??umaczy?? niehomogenno??ci?? wy??
izolowanych bia??ek lub b????dem pope??nionym podczas oznaczania. B????d
tej metody jest du??y, o czym ??wiadczy du??e odchylenie standartowe dla
niekt??rych aminokwas??w. Du??a ilo???? aminokwas??w zasadowych (oko??o
20% ca??o??ci) w por??wnaniu z ma???? ilo??ci?? aminokwas??w dwukarboksylo-
wych oraz w??dr??wka tego bia??ka podczas elektroforezy przy pH 8,6 do
katody pozwala przyj????, ??e mamy do czynienia z bia??kiem zasadowym.
Obecno???? aminokwas??w dwukarboksylowych (oko??o 8% ca??o??ci) w hydro??
lizacie bia??kowym nie ??wiadczy wcale o obecno??ci tych aminokwas??w
w bia??ku, mog?? one bowiem pochodzi?? z glutaminy i asparaginy, kt??re
podczas kwa??nej hydrolizy rozk??adaj?? si?? do wy??ej wymienionych amino??
kwas??w dwukarboksylowych. Tabela 4 por??wnuje jako??ciowy i ilo??ciowy
sk??ad aminokwasowy zasadowego bia??ka mitochondrialnego z nerki wie??
prza z innymi powszechnie znanymi bia??kami zasadowymi. Salmina jest
bia??kiem zawieraj??cym oko??o 90% argininy, a 8 innych aminokwas??w
stanowi tylko 10% ca??o??ci. Inne bia??ka zasadowe, rybonukleazy czy lizo-
zym, posiadaj?? prawie pe??ny sk??ad aminokwasowy. Histony z grasicy
ciel??cej rozdzieli?? Crampton i wsp. [30] za pomoc?? chromatografii na ko??
lumnie z Amberlitu IRC ??? 50 na szereg frakcji, trzy z nich, nazwane
przez niego A, B, C, s?? stosunkowo homogenne [30]; z tych frakcji frak??
cja B jest bia??kiem bogatym w arginin??; frakcja A histon??w, podobnie
jak nasze zasadowe bia??ko mitochondrialne, zawiera sporo lizyny (38%)
i alaniny (18%, jest stosunkowo uboga w arginin?? (oko??o 7%), a nie
posiada aminokwas??w siarkowych i tryptofanu. Bia??ka mitochondrialne
izolowane z nerki wieprza zawieraj?? natomiast sporo proliny (14%). Z po??
r??wnania sk??adu aminokwasowego r????nych bia??ek zasadowych wynika,
??e wyizolowane przeze mnie bia??ko mitochondrialne jest najbardziej pod
tym wzgl??dem zbli??one do pewnych histon??w, np. frakcji A histon??w
grasicy Cramptona, chocia?? ich jako??ciowy i ilo??ciowy sk??ad aminokwa??
sowy nie jest identyczny. Mo??liwe wi??c, ??e zasadowe bia??ko mitochon??
drialne nerki wieprza jest bia??kiem o charakterze histonu, ale histonu
swoistego dla mitochondri??w. Jest ono elektroforetycznie homogenne,
tak??e podczas chromatografii na kolumnie z karboksymetyloceluloz??
daje jeden szczyt bia??kowy; nie wyklucza to jednak mo??liwo??ci, ??e mamy
tu do czynienia z mieszanin?? kilku bia??ek o podobnych w??a??ciwo??ciach
fizykochemicznych.
5. BIA??KO ZASADOWE MITOCHONDRI??W NERKI WIEPRZA JAKO
INHIBITOR AKTYWNO??CI ENZYM??W
Protaminy i histony oraz inne bia??ka zasadowe hamuj?? aktywno????
enzym??w (przegl??d pi??miennictwa [1]). Spo??r??d enzym??w szeregu reakcji
Warburga-Keilina badano inhibicj?? oksydazy cytochromowej otrzymanej
z serca wo??u [35???38], Tabela 5, wg Persona i Fine [37], przedstawia wy??
niki tych bada??.
Tabela 5
Inhibicja aktywno??ci oksydazy cytochromowej
przez r????ne bia??ka zasadowe
Bia??ko zasadowe
St????enie
(|xg/ml)
Inhibicja
(%)
Protamina
0,37
10
0,72
26
1,43
58
2,86
92
Lizozym
28
48
56
74
Histony
33
45
66
89
Rybonukleaza
33
17
100
35
200
50
333
78
Z danych tej tabeli wynika, ??e najmocniejszym inhibitorem jest pro??
tamina, a najs??abszym rybonukleaza. Mo??na wi??c przypuszcza??, ??e im
bardziej zasadowe jest bia??ko, tym mocniej hamuje oksydaz?? cytochro-
mow??. Inhibicj?? wywo??an?? bia??kami zasadowymi (makrokationami)
mo??na odwr??ci??, dodaj??c do uk??ad??w inkubacyjnych substancji o chara??
kterze makroanion??w, jak siarczanu poliglukozy, heparyny ??ub sulfonianu
polietylenu. Przy nadmiarze dodanego makroanionu te?? wyst??puje po??
27
zorna inhibicja oksydazy cytochromowej, powodowana tym, ??e wolny
makroanion wi????e si?? z eytochromem c, unieczynniaj??c go i tym samym
wp??ywaj??c na wyniki oznaczania tego enzymu [37], Inni badacze stwier??
dzili, ??e protamina nie tylko hamuje aktywno???? oksydazy cytochromo??
wej, ale tak??e aktywno???? reduktazy cytochromu c zale??nej od kwasu
bursztynowego oraz aktywno???? oksydazy bursztynowej w mitochondriach
serca wolu [39, 40],
Rysunki 9 i 12 przedstawiaj?? kolejno wp??yw zasadowego bia??ka mito-
chondrialnego nerki i protaminy na aktywno???? nast??puj??cych enzym??w:
w id id
Minuty
Rys. 9. Aktywno???? oksydazy cytochro??
mowej w mitochondriach nerki wie??
prza.
1 ??? kontrola; 2 ??? z dodatkiem 300 i-g/ml
zasadowego bia??ka mitochondrialnego; 3 ???
z dodatkiem 300 ng/ml siarczanu protaminy.
Aktywno???? mierzono manometrycznie zu??y??
ciem tlenu przez mitochondria (0,14 mg N)
w 37??, u??ywaj??c kwasu askorbinowego jako
dawcy elektron??w.
~w id id
Minuty
Rys. 10. Aktywno???? oksydazy burszty??
nowej w mitochondriach nerki wieprza.
1 ??? kontrola; 2 ??? z dodatkiem 300 jig/ml
zasadowego bia??ka mitochondrialnego; 3 ???
z dodatkiem 300 jig/ml siarczanu protaminy.
Aktywno???? mierzono manometrycznie zu??y??
ciem tlenu przez mitochondria (0,28 mg N)
w 37??, u??ywaj??c jako substratu bursztynianu
sodu.
oksydazy cytochromowej (rys. 9), bursztynowej (rys. 10), reduktazy cyto??
chromu c zale??nej od kwasu bursztynowego (rys. 11) oraz zale??nej
od NADH2 (rys. 12) oznaczanych w tym samym preparacie mitochondri??w
nerki wieprza.
Reduktaza cytochromu c zale??na od kwasu bursztynowego jest moc??
niej hamowana przez zasadowe bia??ko mitochondrialne (BM) ??? 90%
inhibicji, ni?? przez protamin?? ???- 72% inhibicji. Inne enzymy s?? bardziej
hamowane przez protamin?? ni?? przez BM w stopniu r????nym dla poszcz??-
28
g??lnych reakcji. Reduktaza cytochromu c: zale??na od NADH2 jak hamo??
wana w takim samym stopniu (oko??o 70%), zar??wno przez BM jak i pro??
tamin??; oksydaza cytochromowa jest bardziej hamowana przez protamin??
(S0%) ni?? przez BM (70%), chocia?? r????nice s?? stosunkowo niewielkie,
natomiast oksydaza bursztynowa jest znacznie bardziej hamowana przez
protamin?? (90% inhibicji) ni?? przez BM (52% inhibicji). Aby przekona??
si?? w jaki spos??b ilo???? danego inhibitora wp??ywa na aktywno???? danego
uk??adu enzymatycznego, dodawano r????ne ilo??ci bia??ek zasadowych do p??y??
n??w inkubacyjnych i oznaczano aktywno???? enzymatyczn??.
Rys. 11. Aktywno???? reduktazy cyto??
chromu c zale??nej od kwasu burszty??
nowego w mitochondriach nerki wie??
prza.
1 ??? kontrola; 2 ??? z dodatkiem 100 ng/ml
siarczanu protaminy; 3	??? z dodatkiem
100 ug/ml zasadowego biaika mitochondrial-
nego. Aktywno???? oznaczono spektroiotomet-
rycznie przy 550 mji, mierz??c przyrost zre??
dukowanego cytochromu c w preparacie
mitochondri??w (0,02 mg N) w 22??? u??ywaj??c
bursztynianu jako substratu.
Rys. 12. Aktywno???? reduktazy cyto??
chromu c zale??nej od NADH2 w mito??
chondriach nerki wieprza.
1 ??? kontrola; 2 ??? z dodatkiem 100 ??tg/ml
zasadowego bia??ka mitochondrialnego; 3 ???
z dodatkiem 100 ;ig/ml siarczanu protaminy.
Aktywno???? oznaczano spektrofotometrycznie
przy 550 m ji, mierz??c przyrost zreduko??
wanego cytochromu c w mitochondriach
(0,02 mg N) w 22??, u??ywaj??c NADH2 Jako
substratu.
Maksymaln?? inhibicj?? oksydaz mo??na by??o uzyska?? po dodaniu bia??ek
zasadowych powy??ej 300 pg/ml i dlatego we wszystkich do??wiadczeniach
z tymi enzymami dodawano do p??ynu inkubacyjnego po 500. pg bia??ek
zasadowych na mililitr. Maksymaln?? inhibicj?? reduktaz cytochromu c:
zale??nej od kwasu bursztynowego oraz NADH2, osi??ga si?? po dodaniu
siarczanu protaminy lub zasadowego bia??ka mitochondrialnego powy??ej
100 pg/ml, chocia?? ju?? przy st????eniu bia??ek 30 pg/ml inhibicja niewie??
le si?? r????ni od maksymalnej. Na podstawie tych wynik??w, we wszystkich
do??wiadczeniach z inhibicj?? reduktaz dodawano bia??ka zasadowe w ilo??ci
i 00 pg/ml.
29
Tabela 6
Inhibicja oksydazy cytochromowej, oksydazy bursztynowej oraz reduktaz cytochro-
mu c zale??nych od kwasu bursztynowego i od NADII- w mitochondriach nerki wie??
prza przez r????ne st????enia bia??ek zasadowych
Aktywno???? oksydazy cytochromowej oraz bursztynowej oznaczano manometrycznie z szybko??ci
zu??ywania tlenu, po 10, 20 i 30 min. inkubacji. Aktywno???? reduktaz cytochromu c zale??nycn
od kwasu bursztynowego i NADH2 oznaczano spektrofotometrycznie, przy 550 m;i, mierz??c
przyrost zredukowanego cytochromu c co 20 sek. przez 3 min.
Enzym
St????enie
inhibitora
(??igml)
Siarczan prota??
miny
Inhibicja
(??
Zasadowe bia??ko
mitochondrialne
Inhibicja
(%)
10
27
25
Oksydaza cytochromowa
100
65
60
300
78
70
600
80
80
10
50
15
Oksydaza bursztynowa
100
80
41
300
87
54
600
90
55
1
10
25
3
30
50
Reduktaza cyt. c zal. od
5
37
58
kwasu bursztynowego
10
46
71
15
53
77
100
70
90
150
73
92
5
35
36
Reduktaza cyt. c zal. od
10
45
42
NADH,
100
68
65
150
70
67
Tabela 7 przedstawia procent inhibicji wy??ej wymienionych uk??ad??w
enzymatycznych, wywo??anej przez BM i protamin?? w mitochondriach
nerki i w??troby szczui???a oraz wieprza.
Por??wnuj??c poszczeg??lne wyniki w tej tablicy mo??na wyci??gn???? nast??pu??
j??ce wnioski: zar??wno dla BM jak i protaminy r????nice w inhibicji po??
mi??dzy dwoma preparatami mitochondri??w w badanych narz??dach
zwierz??cych s?? niedu??e dla wszystkich czterech uk??ad??w enzymatycznych.
Protamina hamuje oksydaz?? bursztynow?? w znacznie wi??kszym stopniu
ni?? BM we wszystkich preparatach mitochondrialnych. Oksydaza cyto-
chromowa jest tak??e mocniej hamowana przez protamin?? ni?? przez BM,
lecz r????nice s?? o wiele mniejsze. Reduktaza cytochromu c, zale??na od
NADH2i jest prawie tak samo inliibowana przez protamin?? jak i przez
30
BM. Reduktaza cytochromu c, zale??na od kwasu bursztynowego, jest
inhibowana przez bia??ka zasadowe w r????nych narz??dach zwierz??cych
w r????ny spos??b: w nerce wieprza BM jest mocniejszym inhibitorem ni??
protamina, w w??trobie wieprza inhibicja jest tego samego rz??du, nato??
miast w nerce i w??trobie szczura protamina jest bardziej aktywnym
inhibitorem ni?? BM.
Tabela 7
Inhibicja niekt??rych uk??ad??w enzymatycznych przenosz??cych elektrony przez zasa??
dowe bia??ko mitochondrialne nerki wieprza (BM) i protamin?? w mitochondriach
nerki i w??troby wieprza oraz szczura
Aktywno???? oksydazy cytochromowej oraz bursztynowej oznaczano manometrycznie szybko??ci??
zu??ywania tlenu po 10, 20 i 30 min. inkubacji. St????enie dodanych bia??ek zasadowych wynosi??o
500 ag/ml. Aktywno???? reduktaz cytochromu c zale??nej od kwasu bursztynowego i NADHj
oznaczano spektrofotometrycznie przy 550 mu, mierz??c przyrost zredukowanego cytochromu
c co 20 sek. przez 3 min.
Mitochondria
Nr
do????
wiad??
czenia
Inhibicja (!)
oksydaza
cytochro-
mowa
oksydaza
bursztyno??
wa
reduktaza
cyt. c zale??na
od kw. bur??
sztynowego
reduktaza
cyt. c zale????
na od
NADHj
BM
prot.
BM
prot.
BM
prot.
BM
prot.
Nerka
1
70
80
52
90
90
73
67
70
wieprza
2
80
90
45
90
92
75
70
75
W??troba
3
73
85
67
82
65
65
64
78
wieprza
4
75
80
65
81
70
75
70
80
Nerka
5
83
92
65
92
51
65
73
79
szczura
6
70
80
63
88
55
70
75
80
W??troba
7
78
88
42
85
60
85
70
72
szczura
8
70
85
51
87
55
80
65
70
Bia??ko zasadowe mitochondri??w, podobnie jak i inne bia??ka zasadowe,
hamuje szereg uk??ad??w enzymatycznych (tab. 7). Stwierdzenie obecno??ci
bia??ek zasadowych w mitochondriach oraz ich wp??ywu na reakcje enzy??
matyczne pozwalaj?? przypuszcza??, ??e tak??e in vivo mog?? one wp??ywa??
na metabolizm mitochondri??w. BM ekstrahuje si?? kwasem sulfosalicy-
lowym z mitochondri??w, a nie mo??na go wyekstrahowa?? 0,25 M sacha??
roz??. Wyizolowane rozpuszcza si?? dobrze w wodzie oraz kwa??nych i za??
sadowych buforach. Przemawia to za tym, ??e BM jest po????czone ze
struktur?? tych element??w podkom??rkowych prawdopodobnie jonowo
z kwa??nymi bia??kami i fosfolipidami. Odpowiednie st????enie kwasu sul-
fosalicylowego dysocjowa??oby te po????czenia i w ten spos??b BM przecho??
dzi??oby do roztworu, podobnie jak przechodz?? do roztworu kwasu siarko??
wego histony z j??der kom??rkowych, po????czone w tych j??drach z kwasem
desoksyrybonukleinowym. Za tym przypuszczeniem przemawiaj?? wyniki
31
do??wiadcze?? in vitro, w kt??rych stwierdzono ????czenie si?? bia??ek zasado??
wych z bia??kami kwa??nymi [41???44], Takie po????czenia bia??ek zasadowych
z kwa??nymi komponentami mog??yby dysocjowa?? w r????nych miejscach mi-
tochondri??w pod wp??ywem lokalnych zmian pH, lub st????enia soli, a uwol??
nione w ten spos??b zasadowe bia??ka mitochondrialne hamowa??yby aktyw??
no???? enzym??w w danym miejscu mitochondrionu i w ten spos??b wp??ywa??
??yby koordynuj??co na ich metabolizm. Trudno ??ci??le okre??li??, na jakie po??
szczeg??lne reakcje enzymatyczne BM dzia??a hamuj??co. Przedmiotem bada??
nia by??y bowiem nie poszczeg??lne reakcje enzymatyczne, ale uk??ady
enzymatyczne rozmieszczone w strukturze mitochondrionu. Przyjmuj??c
schemat systemu przenosz??cego elektrony w mitochondriach, tak jak to
podaje pracownia Greena [45], poszczeg??lne badane w tej pracy uk??ady
enzymatyczne przedstawia schemat.
Schemat uk??adu przenosz??cego elektrony w mitochondriach oraz schematy badanych
fragment??w tego uk??adu
NADH2
Eursztynian	*???
Bursztynian	>
NADII;,
Askorbinian	*???
Bursztynian	?????
Fn ??? Fe(n-
I
-h)
F??? ??? Fe(n???h)
\ ^ Cyt. b
Q	Cvt. c
/ Cyt. Cj
Cyt. a
???l	Cyt. b
F??? ??? Fe(n??? h)	>??? Q	 Cyt. c
Cyt. Ci
Cyt. b
Fn ??? Fe(n???h) > Q???	 Cyt. c
Cyt. d
Cyt. c	*??? Cyt. a ??? Cu	* 02
Cyt. b
F??? ??? Fe(n???h) ?????? Q ???	 Cyt. a ??? Cu	>
i	cy1-c???
Cu
o2
I	??? Uk??ad przenosz??cy elektrony w mitochondriach
II	??? Uk??ad reduktazy cytochromu c zale??nej od kwasu bursztynowego
III	??? Uk??ad reduktazy cytochromu c zale??nej od NADHg
IV	??? Uk??ad oksydazy cytochromowej
V	??? Uk??ad oksydazy bursztynowej
FN ??? Flawoproteid dehydrogenazy NADH2
Ffi ??? Flawoproteid dehydrogenazy kw. bursztynowego
Q ??? Koenzym Q
Fe (n-h) ??? ??elazo niehemowe
02	(I)
(II)
(III)
(IV)
(V)
Jak wida?? ze schematu, badane uk??ady enzymatyczne sk??adaj?? si??
z kilku etap??w, z wyj??tkiem mo??e reakcji oksydazy cytochromowej; trud??
no jest wobec tego rozstrzygn????, kt??ry z nich jest inhibowany przez ba??
dane bia??ko zasadowe. Otrzymane wyniki zdaj?? si?? wskazywa??, ??e za??
r??wno BM, jak i protamina wp??ywaj?? co najmniej na dwa etapy, tj. na
oksydaz?? cytochromow?? oraz na jeden z etap??w pomi??dzy bursztynianem
lub NADH2 a cytochromem c; mog?? to by?? nast??puj??ce reakcje: bursz??
tynian lub NADH2 ??? nukleotydy flawinowe, nukleotydy flawinowe ??? ko??
enzym Q, oraz koenzym Q ??? cytochrom c. Wydaje si??, ??e pewne przy??
puszczenia mo??na snu?? z faktu, ??e BM w niekt??rych preparatach mito-
32
chondrialnych hamuje aktywno???? oksydazy bursztynowej zaledwie do
po??owy, podczas gdy aktywno???? innych uk??ad??w enzymatycznych, b??d????
cych sk??adowymi oksydazy bursztynowej w tych samych preparatach
mitochondri??w, hamuje ono w znacznie wi??kszym stopniu; np. w mito-
chondriach nerki wieprza oksydaza bursztynowa jest hamowana w 50'Vo,
podczas gdy reduktaza cytochromu c, zale??na od kwasu bursztynowego
oraz oksydaza cytochromowa s?? hamowane odpowiednio 90 i 70% (tab. 7).
Wiadomo tak??e, ??e w uk??adzie oksydazy bursztynowej reakcj?? ogranicza??
j??c??, tj. najwolniej przebiegaj??c??, jest reakcja dehydrogenazy kwasu
bursztynowego [46], a oznaczanie aktywno??ci oksydazy bursztynowej
z ilo??ci zu??ytego tlenu jest w??a??ciwie oznaczeniem aktywno??ci dehydro??
genazy kwasu bursztynowego [18J. Na podstawie tych fakt??w mo??na by
t??umaczy?? zjawisko, ??e oksydaza bursztynowa w niekt??rych preparatach
mitochondrialnych jest s??abiej hamowana przez BM, ni?? uk??ady reakcji
b??d??ce jej elementami sk??adowymi, tym, ??e zasadowe bia??ko mito-
chondrialne hamuje oksydaz?? cytochromow?? oraz jeden lub kilka etap??w
pomi??dzy nukleotydem flawinowym a cytochromem c, natomiast nie ha??
muje wcale lub w bardzo nieznacznym stopniu dehydrogenaz?? kwasu bur??
sztynowego. Pozosta??a, nawet niewielka, aktywno???? tych inhibowanych
enzym??w wystarczy, by znaczn?? cz?????? elektron??w z kwasu bursztynowe??
go przenie???? na tlen. Gdyby natomiast by??a hamowana dehydrogeneza
kwasu bursztynowego, to powinien by?? w tym samym stopniu inhibo-
wany uk??ad oksydazy bursztynowej jak i reduktazy cytochromu c zale????
nej od kwasu bursztynowego.
Mechanizm inhibicji enzym??w przenosz??cych elektrony t??umacz??
i????ni autorzy w r????ny spos??b. Smith i Conrad [47] uwa??aj??, ??e inhibicja
oksydazy cytochromowej wywo??ana przez protamin?? jest podobna do
inhibicji tego enzymu wywo??anej przez du??e st????enie cytochromu c, b??d????
cego te?? bia??kiem zasadowym. Znany jest fakt, ??e pomiar aktywno??ci
oksydazy cytochromowej metod?? manometryczn?? z szybko??ci znikania
tlenu, oraz aktywno??ci oksydazy cytochromowej spektrofotometrycznie
szybko??ci?? znikania zredukowanego cytochromu c, daje- r????ne wyniki.
Wed??ug Smitha i Conrada r????nice te daj?? si?? wyt??umaczy?? r????nym st????
??eniem cytochromu c u??ytym w ka??dym z tych oznacze?? [47], Cyto-
chrom c dodawany w coraz wi??kszej ilo??ci z jednej strony przy??piesza????
by przenoszenie elektron??w, ale z drugiej strony hamowa??by aktywno????
oksydazy cytochromowej. Oznaczanie wi??c aktywno??ci wy??ej wymienio??
nymi metodami by??oby wypadkow?? tych dw??ch dzia??a??. Taka hipoteza
t??umaczy dobrze r????nice w oznaczeniu oksydazy cytochromowej przy
u??yciu r????nych ilo??ci cytochromu c. Do??wiadczenia przeprowadzone przez
Smitha i wsp. potwierdzaj?? te przypuszczenia. Wynika z nich, ??e utle??
nianie zredukowanego cytochromu c przez oksydaz?? cytochromow?? jest
reakcj?? pierwszego rz??du a?? do st????enia cytochromu wynosz??cego 130 uM.
Jednak sta??e szybko??ci tej reakcji w miar?? wzrostu st????enia cytochro-
33
mu c malej?? [47], Zgodne to jest z hipotez??, ??e cytochrom c Jest inhibi??
torem oksydazy cytochromowej. Autorzy przypuszczaj??, ??e cytochrom c
jest dlatego inhibitorem oksydazy cytochromowej, poniewa?? jest bia????
kiem zasadowym, wobec tego inne bia??ka zasadowe powinny mie?? podob??
ne dzia??anie hamuj??ce [35]. Takemori i wsp. t??umacz?? inhibicj?? oksydazy
cytochromowej przez bia??ka zasadowe ????czeniem si?? tych bia??ek z oksyda??
z?? cytochromow?? [38], Opieraj?? oni swoj?? hipotez?? na nast??puj??cych do??
??wiadczeniach. Cytochrom a, zredukowany przez p-fenylenodwuamin??,
nie mo??e ulec utlenieniu w nieobecno??ci cytochromu c, natomiast nie??
wielki dodatek tego zwi??zku powoduje szybkie utlenienie zredukowa??
nego cytochromu a przez tlen [48], Reakcja bezpo??rednia pomi??dzy cyto-
chromem Ci i cytochromem a jest bardzo powolna. Po??rednikiem w prze??
noszeniu elektron??w w tej reakcji jest cytochrom c??? Na podstawie tych
wynik??w badacze ci przypuszczaj??, ??e cytochrom c nie tylko redukuje
cytochrom a, ale jest tak??e koenzymem oksydazy cytochromowej przez
????czenie si?? z cytochromem a. Kompleks oksydazy cytochromowej sk??a??
da??by si?? zatem z cytochromu a, fosfolipid??w, miedzi [49] oraz cyto??
chromu c. Powstaje wi??c pytanie, w jaki spos??b ????czy si?? cytochrom a
z cytochromem c. Poniewa?? cytochrom c jest bia??kiem zasadowym [50],
zawieraj??cym 20% lizyny [51], to wolne grupy aminowe mog??yby si??
????czy?? z kwa??nym bia??kiem ??? cytochromem a 1381. Cytochrom c z za??
blokowanymi w 30% grupami aminowymi, przez acylacj?? kwasem
octowym lub bursztynowym, traci ca??kowicie zdolno??ci aktywacji
oksydazy cytochromowej. Podobnie dzia??a zmieniony cytochrom c pod
wp??ywem kwasu 2,4,6-tr??jnitrobenzenosulfonowego. Kwas ten w obo??
j??tnym pH blokuje tylko 4 grupy s-aminowe lizyny na mol cytochro??
mu c, ale mimo to tak zmieniony cytochrom c traci zdolno??ci aktywo??
wania oksydazy cytochromowej [38], Efekt chemicznie zmienionych
cytochrom??w c na redukcj?? cytochromu a wyst??puje dopiero wyra????
nie przy zablokowaniu du??ej ilo??ci wolnych grup aminowych. Cyto??
chrom c z czterema grupami $-aminowymi lizyny zablokowanymi przez
kwas 2,4,6-tr??jnitrobenzenosulfonowy lub z 30% zablokowanych grup
drog?? acetylacji w nieznacznym tylko stopniu obni??a redukcj?? cytochro??
mu a. Zablokowanie wolnych reszt aminowych w 65% przez kwas octo??
wy powoduje spadek zdolno??ci redukcji cytochromu a o oko??o 50%. Cyto??
chrom c, w kt??rym 90% wolnych reszt aminowych jest zablokowane przez
reszty gwanidylowe (dodatnio na??adowane), nie tylko nie hamuj?? redukcji
cytochromu a i aktywno??ci oksydazy cytochromowej, ale nawet t?? pier??
wsz?? reakcj?? przy??pieszaj?? [38], Te wyniki mog?? sugerowa??, ??e pewne
grupy aminowe cytochromu c, blokowane przez kwas 2,4,6-tr??jnitroben-
zenosulfonowy ????cz?? si?? z cytochromem a, w wyniku czego powstaje
aktywny zwi??zek o charakterze oksydazy cytochromowej. O wiele trud??
niej jest obni??y?? zdolno??ci redukcji cytochromu a przez cytochrom c
drog?? blokowania wolnych grup aminowych. Cytochrom a r??wnie dobrze
34
m??g??by si?? ????czy?? z innymi bia??kami zasadowymi, np. protamin??; powsta??
??e po????czenie uniemo??liwi??oby aktywowanie oksydazy cytochromowej
przez cytochrom c, czego nast??pstwem by??oby hamowanie jego aktyw??
no??ci [38], Za t?? koncepcj?? przemawiaj?? do??wiadczenia in vitro, w kt??rych
otrzymywano trwa??e po????czenia zasadowych i kwa??nych bia??ek [41, 42],
Machinist i wsp. badaj??c wp??yw protaminy na procesy oksydoredukcyjne
zachodz??ce w mitochondriach wysuwaj?? nast??puj??c?? hipotez?? t??umacz??c??
hamowanie tych proces??w przez bia??ka zasadowe [40], W b??onie mito??
chondrialnej, zawieraj??cej du??o fosfolipid??w (przede wszystkim kefalin),
znajduj?? si?? ujemnie na??adowane kanaliki; cytochrom c, znajduj??cy si??
wewn??trz mitochondri??w, dopiero wtedy mo??e przenie???? elektron z zew??
n??trznego cytochromu c (znajduj??cego si?? w p??ynie inkubacyjnym), je??eli
przedtem po????czy si?? z fosfolipidami b??ony mitochondrialnej, otaczaj????
cymi kanalik w tej b??onie. Wtedy dodatnio na??adowany zewn??trzny cyto-
chiom c, wchodz??c w ujemnie na??adowane pory b??ony mitochondrialnej,
otrzymuje elektron od wewn??trznego cytochromu c. Je??eli doda si?? pro??
taminy lub innego bia??ka zasadowego, to blokuje ono ujemnie na??adowane
poi y pi zez ????czenie si?? z fosfolipidami b??ony mitochondrialnej i tym sa??
mym uniemo??liwia wymian?? elektron??w pomi??dzy wewn??trznym i zew??
n??trznym cytochromcm c. Za t?? hipotez?? przemawiaj?? do??wiadczenia
in vitro Reicha i Wainio z tworzeniem si?? kompleks??w cytochromu c
z wyekstrahowanymi lipidami z mitochondri??w, przede wszystkim z kefa-
lin?? [52], oraz Chargaffa i wsp., kt??rzy stwierdzili ????czenie si?? in vitro
fosfolipid??w z protamin?? [43, 44],
Pizyjmuj??c kt??r??kolwiek z tych hipotez, t??umacz??cych hamowanie
enzym??w przenosz??cych elektrony przez bia??ka zasadowe, w do??wiadcze??
niach przedstawionych w tej pracy protamina jako bia??ko bardziej zasa??
dowe (80???90% argininy) powinna ka??dy z badanych uk??ad??w enzyma??
tycznych hamowa?? mocniej ni?? s??abiej zasadowe bia??ko mitochondrialne
(30% aminokwas??w zasadowych). Z danych tabeli 9 wynika, ??e wpraw??
dzie wi??kszo???? enzym??w jest inhibowaha mocniej przez protamin?? ni??
przez zasadowe bia??ko mitochondrialne, jednak dla niekt??rych reduktaz
l????nice te si?? znacznie wahaj??, a nawet reduktaz?? cytochromu c zale??n??
od kwasu bursztynowego w mitochondriach nerki wieprza mocniej inhi-
buje zasadowe bia??ko mitochondrialne (nerki wieprza) ni?? protamina.
Przeciwnie, w mitochondriach nerki szczura inhibicja reduktazy cyto-
chiomu c zale??nej od kwasu bursztynowego jest wi??ksza przez protamin??
ni?? przez zasadowe bia??ko mitochondrialne. Te fakty mo??na by interpre??
towa?? jako swoisty efekt zasadowego bia??ka mitochondrialnego nerki
wieprza na reakcje enzymatyczne w homologicznej tkance.
6. WNIOSKI
Praca niniejsza uzupe??nia nieliczne dotychczasowe wiadomo??ci o bia????
kach zasadowych w strukturach podkom??rkowych, a w szczeg??lno??ci
w mitochondriach. Materia??em badanym by??a nerka wieprza. Obecno????
bia??ek zasadowych w mitochondriach nerek wykazano pos??uguj??c si??
a) ekstrakcj?? bia??ek ze struktur podkom??rkowych kwasem sulfosalicy-
lowym, b) elektroforez?? bibu??ow?? tych bia??ek, c) oznaczaniem ilo??cio??
wym bia??ek wyekstrahowanych z poszczeg??lnych struktur podkom??rko??
wych. Bia??ko zasadowe mitochondri??w wyizolowano pos??uguj??c si?? chro??
matografi?? na karboksymetylocelulozie, a jako??ciowy i ilo??ciowy sk??ad
aminokwasowy zbadano przy pomocy chromatografii bibu??owej. Zawiera
ono oko??o 25% lizyny, po oko??o 15% alaniny i proliny, 10% glicyny,
innych aminokwas??w: leucyny, waliny, seryny, kwasu glutaminowego
i treoniny po kilka procent, a kwasu asparaginowego i histydyny mniej
ni?? 1 %. Wykazano, ??e wyizolowane bia??ko zasadowe mitochondri??w inhi-
buje kilka uk??ad??w enzymatycznych szeregu Warburga-Keilina, a mia??
nowicie oksydaz?? cytochromow??, oksydaz?? bursztynow?? oraz reduktazy
cytochromu c zale??ne od kwasu bursztynowego i NADH2. Por??wnuj??c
inhibicj?? tych enzym??w, wywo??an?? przez bia??ka zasadowe mitochondri??w
z inhibicj?? wywo??an?? przez protamin?? mo??na przypuszcza??, ??e zasadowe
bia??ko mitochondrialne nerki wieprza dzia??a swoi??cie na reakcje enzy??
matyczne w homologicznej tkance.
PI??MIENNICTWO
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
36.
17.
18.
??rST W" Bi0l??giCZne w??asno??ci bia??ek zasadowych, Post??py Biochemii, 9,
Mejbaum-Katzenellenbogen W., Insoluble protein-tanin compounds, Acta Bio-
chim. Polon., 6, 375 (1959).
Mejbaum-Katzenellenbogen W., Studies on regeneration of protein from insoluble
protem-tanin compounds, 1. Removal of tanin from the protein-tanin compound
by coffeme, Acta Biochim. Polon., 6, 385 (1959).
Mejbaum-Katzenellenbogen W., Morawiecka B., Badanie nad regeneracj?? bia??ek
z nierozpuszczalnych po????cze?? bia??kowo-taninowych. II. Niekt??re w??asno??ci bia??
??ek regenerowanych na przyk??adzie aldolazy z mi????ni kr??lika i kwa??nej fosfatazy
z ziemniak??w, Acta Biochim. Polon., 6, 453 (1959).
Mejbaum-Katzenellenbogen W., Morawiecka B., Dobryszycka W??? Badania nad
regeneracj?? bia??ek z nierozpuszczalnych po????cze?? bia??kowo-taninowych, III. Bia??-
a rozpuszczalne w kwasie sulfosalicylowym (glikoproteidy), Acta Biochim. Po-
lon.y 7, 401 (1960).
Woife L. S??? Mcllwain H??? Migration of histones from the nuclei of isolated ce-
rebral tissues kept in cold media, Biochem. J78, 33 (1961)
Davison P. F., Histones from normal malignant cells, Biochem. J., 66, 703 (1957).
Pluklnun H??? Gotting H??? Beitrag zur Methode der Elektrophoretischen Unter??
suchungen der Serumeiweiskorper auf Filtrierpapier, Klin. Wochr., 29 415 (1951)
Mejbaum-Katzenellenbogen W., Turbidimetryczna metoda oznaczania bia??ek ta??
nin??, Acta Biochim. Polon., 2, 279 (1955).
SPectr??Photometric and turbidimetric methods for measuring proteins,
?ress??i. Y.1957Zym0l??gy???	^ 44?' ^ S' R Colowick??? N'??' KaPlan> Academic
SemT75A1244auS F' E" ??Unn M' S??? A" expresion of Sradient elution, Annal.
B1??Ck J-??? Durrum E- L., Zweig G??? A manua?? of paper chromatography and pa??
per elektrophoresis, Academic Press N. Y. (1955).
333ya95^)??? The ninhydrin reaction and it8 analytical applications, Biochem. J. 67,
Krebs H. A., Bellamy D??? The interconversion of glutamic acid and aspartic acid
in respiring tissues, Biochem. J., 75, 523 (I960).
T??? In,terfer/nC,e by amino acids and Peptides with the photometric esti??
mation of proline, Analit. Biochem., 2, 353 (1961).
Syennerhol L., Quantitative estimation of salic acids. II. A colometric resorcinol
hydrochloric acid method, Biochim. Biophys. Acta, 24, 604 (1957).
Winzler R.J Methods for determinations of serum glycoproteins, Methods of
Biochemical Analysis, t. 2, s. 290, wyd. D. Glic, Interscience Publishers N. Y. 1955
,Thc homogenate technique. Manometrie Techniques, s. 170, wyd.
. W. Umbreit, R. H. Burns, J. F. Staufer, Burgers Publishing Co. 1959.
37
19.	Slatter E. C., The dihydrocozymaze-cytochrome c reductase activity of heart-mu??
scle preparations, Biochem. J., 46, 499 (1950).
20.	Theorell H., Akesson A., Studies on cytochrome c., I. Electrophoretic purification
of cytochrome c and its amino acid composition, J. Amer. Chem. Soc., 63, 1804
(1941).
21.	Felix K., Protamines, nucleoprotamines and nuclei, Amer. Sci., 43, 431 (1955).
22.	Markham R., Smith J. D., Nucleoproteins and viruses, The Proteins, t. II, cz. A,
wyd. H. Neurath, K. Pailey, Academic Press N. Y. 1954.
23.	Burston D., Tombs M. P., Maclagan M. F., Protein of human-tissue exstracts
separation by column chromatography, Biochem. J., 81, 40 p (1961).
24.	Burston D., Tombs M. P., Maclagan N. F., Perchloric acid-soluble protein, Bio??
chem. J., 84, 89 P (1962).
25.	Rzeczycki W.,???Hillar M., An electropositive protein fraction obtained from animal
tissues while extracted with sulphosalicylic acid, V-th International Congress of
Biochemistry Moscow, 1961, 21, 41, Pergamon Press.
26.	Hartshorne D. J., Perry S. V., A chromatographic and electrophoretic study of
sarcoplasm from adult and foetal-rabbit muscles, Biochem. J. 85, 171 (1962).
27.	Bloom W. L., Watson D. W., Cromatric W. J., Freed M., Studies on infection with
bacillus anthracis IV. Preparations and characterisation of anthracidal substance
from various tissues, J. of Infect. Vis., 80, 41 (1947).
28.	Hirch J. G., Dubes R. J., Chemical studies on a basic peptide preparation deri??
ved from calf thymus, J. Exp. Med., 99, 65 (1954).
29.	Gregore I.( Limozin M., Reserches sur l???heterogeneite et la composition des
preparations de thimohistone, Bull. Soc. Chim. Biol. 36, 15 (1954).
30.	Crampton C. F., Moore S., Stein W. H., Chromatographic fractionation of calf
thymus histones, J. Biol. Chem., 215, 787 (1955).
31.	Davison P. F., Chromatography of histones, Biochem. J., 66, 709 (1957).
32.	Corfield M. C., Robson A., The amino acid composition of salmine; Biochem. J.,
55, 517 (1953).
33.	Hirs C. W., Moore S., Stein W. H., Peptides obteined by tryptic hydrolysis of
perl'ormic acid-oxidized ribonuclease, J. Biol. Chem., 219, 623 (1956).
34.	Dose K., Capute A., Die Anwendung der Hochspanungphorographie bei der Quan??
titative?? Total Analyze von Proteinhydrolysaten Untersuchung am Lysosym,
Biochem. Z., 328, 376 (1956).
35.	Smith L., Conrad H., Reaction of cytochrome c oxidase activity to the nature of
the tissue preparations, Feder Proc., 17, 313 (1958).
36.	Person P., Fine S. A., Reversible inhibition of beef heart cytochrome c oxidase
by polyionic macromolecules, Science, 132, 42 (1960).
37.	Person P., Fine S. A., Reversible inhibitions of cytochrome system components
by macrornolecular polyions, Arch. Biochem. Biophys., 94, 392 (1961).
38.	Takemori S., Wada K., Sekuzu I., Okunuki K., Reaction of cytochrome a with
chemically modified cytochrome c and basic proteins, Nature, 195, 456 (1952).
39.	Minneaert K., Smith L., Reactions of cytochrome c with respiratory chain pre??
parations, V-th International Congress of Biochemistry 23, 467, Pergamon Press,
Moscow 1961.
40.	Machinist J. M., Das M. L., Crane F. L., Jacobs E. F., A negatively charged pore
in the mitochondrial membrane as a site for cytochrome e function, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 6, 475 (1961/62).
41.	Haurowitz F., Turner J. E., Kennedy M. H., Iber die gegenseitige Bindung von
Eiweiss und Protamine, Z. Phys. Chem., 315, 137 (1959).
42.	Nagumo T., Complexes between acidic and basic proteins, J. Biochem. (Tokyo),
49, 379 (1961).
38
43.	Chargaff E??? Studies on the chemistry of blood coagulations, VII. Protamines
and blood clotting, J. Biol. Chem., 125, 671 (1938).
44.	Chargaff E??? Ziff M., The compounds between phophatides and basic proteins
J. Biol. Chem., 131, 25 (1939).
45.	Hatefi Y., Haavik A. G., Fowler L. R??? Griffiths D. E??? Studies on the electron
transfer system, XLII. Reconstitution of the electron transfer system, .7. Biol.
Chem., 237, 2661 (1962).
46.	Schneider W. C., Potter V. R., The assay of animal tissues for respiratory enzy??
mes. II. Succinic dehydrogenase and cytochrom exidase, J. Biol. Chem., 149 217
(1943).
47.	Smith L., Conrad H., A study of kinetics of the oxidation of cytochrome c oxi??
dase, Arch. Biochem. Biophys., 63, 403 (1956).
48.	Sekuzu I., Takemori S., Orii Y., Okunuki K., Studies on cytochrome a, IV. Rea??
ction of cytochrome a with cytochromes c and c??? Biochim. Biophys. Acta 64
37 (1960).
49.	Wainio W. W., Composition of cytochrome c oxidase, Haematin Enzymes, s. 281,
wyd. J. E. Falk, E. Lemberg, R. K. Morton, Pergamon Press 1961.
;?0. Theorell H. J., Studies on cytochrome c, IV. The magnetic properties of ferric
and ferrous cytochrome c, J. Amer. Chem. Soc., 63, 1820 (1941).
51.	Ehenberg A., Theorell N., On the stereochemical structure of cytochrome c, Acta
Chem. Scand., 9, 1195 (1954).
52.	Reich M., Wainio W. W., A cytochrom c-phospholipid complex, J. Biol. Chem.,
236, 3058 (1961).
38
43.	Chargaff E??? Studies on the chemistry of blood coagulations, VII. Protamines
and blood clotting, J. Biol. Chem., 125, 671 (1938).
44.	Chargaff E??? Ziff M., The compounds between phophatides and basic proteins
J. Biol. Chem., 131, 25 (1939).
45.	Hatefi Y., Haavik A. G., Fowler L. R??? Griffiths D. E??? Studies on the electron
transfer system, XLII. Reconstitution of the electron transfer system, .7. Biol.
Chem., 237, 2661 (1962).
46.	Schneider W. C., Potter V. R., The assay of animal tissues for respiratory enzy??
mes. II. Succinic dehydrogenase and cytochrom exidase, J. Biol. Chem., 149 217
(1943).
47.	Smith L., Conrad H., A study of kinetics of the oxidation of cytochrome c oxi??
dase, Arch. Biochem. Biophys., 63, 403 (1956).
48.	Sekuzu I., Takemori S., Orii Y., Okunuki K., Studies on cytochrome a, IV. Rea??
ction of cytochrome a with cytochromes c and c??? Biochim. Biophys. Acta 64
37 (1960).
49.	Wainio W. W., Composition of cytochrome c oxidase, Haematin Enzymes, s. 281,
wyd. J. E. Falk, E. Lemberg, R. K. Morton, Pergamon Press 1961.
;?0. Theorell H. J., Studies on cytochrome c, IV. The magnetic properties of ferric
and ferrous cytochrome c, J. Amer. Chem. Soc., 63, 1820 (1941).
51.	Ehenberg A., Theorell N., On the stereochemical structure of cytochrome c, Acta
Chem. Scand., 9, 1195 (1954).
52.	Reich M., Wainio W. W., A cytochrom c-phospholipid complex, J. Biol. Chem.,
236, 3058 (1961).
'
'
Biblioteka G????wna
Akademii Medycznej w Gda??sku
178503